生猪重要疫病样品采集要求与实验室检测意义

生猪重要疫病样品采集要求

与实验室检测意义李峰研究员山东省滨州畜牧兽医研究院山东省生猪创新团队滨州综合试验站分享内容实验室检测的重要意义实验室检测的主要内容生猪主要疫病样品采集要求与本卷须知其他样品采集要求实验室检测的重要意义明确所发生的疾病种类：传染性因素：细菌、病毒、支原体、其它微生物；非传染性因素单纯感染/混合感染是否为人兽共患病病原分子生物学检测分析区域优势毒株基因型分析病原分子进化与演变病原分子序列与疫苗比对细菌的染色↓形态学观察↓培养基的制备↓细菌别离培养↓纯化↓细菌的生化试验↓药物敏感试验病猪的剖检病猪病料的采集、保存总RNA的提取↓反转录↓聚合酶链式反响〔PCR〕猪瘟病毒抗体猪伪狂犬病病毒gPI抗体(野毒)猪流感血凝抑制试验猪细小病毒病乳胶凝集试验〔LAT〕猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体↓DNA提取↓PCR血清学检测分子诊断细菌别离↓结果分析生猪主要疫病样品采集要求采样原那么1、适时采集：尽可能采集到新鲜样品。用于别离病原体的，须在病初发热期或出现典型临诊病症时采集；假设制备血清，空腹时采血。尸体上采样，应在动物死后立即采集。2、典型采样：样品具有代表性。选择典型动物，即未经药物治疗、病状典型的动物；选择典型材料，病原体含量最高的材料；尸体采样，采集有病变组织、器官或病变最明显、最典型的部位。3、合理采样：群体发病时，至少采5头动物的病料。每一种样品应有足够的数量。4、无菌采样：无菌操作，尤其是供微生物学检查和血清学检查的样品5、平安采样：注意人员平安，防止感染，防止病原扩散造成环境污染。病理剖检腹部朝上平放切开四肢颈部淋巴结股内那么淋巴结剖检颌、颈部皮下组织、颌下淋巴结观察横切胸骨柄，暴露胸腹腔观察胸腹腔器官变化纵切胸骨柄取出胸腔器官剖开颅腔暴露脑部器官症状/病变疑似疾病体表耳尖、屁股、腹部发紫微循环障碍：猪瘟、弓形体背部发紫，规则菱形，边缘整体猪丹毒全身通红链球菌鼻子流血和/泡沫胸膜肺炎背部点状出血、毛孔出血、皮肤发白附红细胞体、蓝耳病会阴、臀部、四肢出现周边紫色，中间白色圆形、边缘紫褐色纽扣状坏死圆环病毒依据剖检病变推导可能发生疫病淋巴结颌下淋巴结肿大，出血性坏死全身淋巴结有大理石样出血变化腹股沟浅淋巴结水肿、切口外翻，表面苍白，渗出透明液体咽、颈及肠系膜淋巴结黄白色干酪样坏死灶淋巴结充血、水肿、小点状出血

支气管淋巴结、肠系膜淋巴结髓样肿胀猪炭疽、链球菌病猪瘟、蓝耳、猪肺疫圆环病毒2型猪结核急性猪肺疫、猪丹毒、链球菌病猪气喘病、猪肺疫、传染性胸膜肺炎、副伤寒血液血液黑或发紫，不凝固中毒，内源性毒素：弓形体、胸膜肺炎、链球菌、猪丹毒血液不凝固、稀薄贫血，蓝耳、附红细胞体呼吸道喉头出血猪瘟扁桃体化脓、出血猪瘟、伪狂犬喉头有泡沫蓝耳、副猪、传胸气管有很多粘液细菌性疾病肺出血斑点纤维素性肺炎心叶、尖叶、中间叶肝样变水肿，小点状坏死粟粒性、干酪样结节表面零星、边界清楚、湿润肉样变猪瘟猪肺疫、传染性胸膜肺炎气喘病弓形体病结核病流感心脏心包积液心包炎、心外膜炎（绒毛心）心外膜斑点状出血心肌条纹状坏死带心内膜出血心瓣膜呈菜花样心肌内有米粒大灰白色包囊泡副猪、传胸副猪、传胸、气喘病猪瘟、猪肺疫、链球菌病口蹄疫败血症链球菌、慢性猪丹毒猪囊尾蚴病肝淤血肿大沙门氏菌表面灰白色或灰黄色纤维素沙门氏菌病、副猪、大肠杆菌白色坏死点，弥漫性坏死沙门氏菌、伪狂犬、霉菌毒素、中毒脂肪肝传染性胃肠炎、流行性腹泻、仔猪大肠杆菌胆囊肿大、胆汁粘稠沙门氏菌胆囊肿大，胆汁呈黄色泥状圆环病毒脾脾边缘有锯齿状出血、梗死弥漫性出血淤血肿大，坏死脾边缘有小点状出血猪瘟、仔猪副伤寒猪瘟、猪丹毒、弓形体、猪肺疫弓形体病，霉菌毒素中毒（全）仔猪红痢胃胃粘膜斑点状出血，溃疡胃粘膜充血、卡他性炎症，呈大红布样/麦麸状假膜粘膜下水肿胃壁增厚猪瘟、胃溃疡猪丹毒、食物中毒副伤寒水肿病水肿、大肠杆菌、魏氏梭菌肠乳糜管内无脂肪、出血病毒性腹泻乳糜管内有脂肪细菌、球虫或营养性腹泻肠壁有白色绿豆大肉芽肿、淋巴滤泡增生沙门氏菌、食道线虫（大肠）、球虫（结肠、盲肠）浆膜出血猪瘟回盲瓣出血、坏死，盲肠扣状肿猪瘟肠粘膜出血流感、梭菌性肠炎、增生性肠炎肾苍白，针尖状出血猪瘟、伪狂犬淤血、肿大猪丹毒、梭菌、链球菌（紫红色、红棕色）；蓝耳（紫黑色）；增生性肠炎（灰黑色，肾乳头淡黑色）灰白色、表面隆突不平圆环病毒膀胱粘膜层有出血斑点猪瘟睾丸1个或2个睾丸肿大、发炎、坏死或萎缩乙型脑炎、布氏杆菌病关节肿大、积液副猪、链球菌依据病种确定主要采集病料病名病原主要临床症状特征病理变化主要病料采集实验室诊断猪瘟HCV体温41℃左右，脓性结膜炎，皮肤红斑点，指压不退色，先便秘后腹泻，公猪包皮囊积尿，小猪多有神经症状。实质器官多发性出血性为特征的败血症病变，肾脏有出血点或斑，尿道、膀胱、喉头均有出血点，脾脏边缘梗死。扁桃体、淋巴结、脾脏、肾脏和血清接种PK15细胞、分离病毒；ELISA、RT-PCR、GIA检测病原猪繁殖与呼吸障碍综合征（蓝耳病）PRRSV母猪流产，早产，死胎，木乃伊胎。胎儿大小比较一致，少数病猪双耳、尾部等发生短暂性皮肤紫绀。哺乳仔猪呈结膜炎，呼吸障碍及流鼻涕。青年猪见呼吸道症状。间质性肺炎；肺水肿；淋巴结肿大呈褐色。病猪的肺、流产胎儿的肠和腹水、母猪血清、鼻拭子、粪便、扁桃体、脾、淋巴结接种Marc-145细胞分离鉴定；ELISA方法检测抗体；分子生物学RT-PCR病名病原主要临床症状特征病理变化主要病料采集实验室诊断猪伪狂犬病PRV引起怀孕母猪流产，以死胎为主。仔猪也可出现体温升高，呼吸困难，下痢和特征性神经症状，15日龄以内仔猪易感，病死率可达100%。木乃伊胎或死胎重吸收。扁桃体白色溃疡或坏死灶，肝脏表面白色坏死点，脾脏白色坏死灶。脑部水肿等。扁桃体、脊髓、淋巴结、脑组织动物试验；接种vero细胞分离病毒；PCR检测病原。猪圆环病毒病PCV2被毛粗乱，喜挤堆，精神沉郁，呼吸急促，皮肤苍白，腹泻，消瘦。淋巴结异常肿大、切面为白色。脾脏肿大，肾脏肿大呈土黄色，并有散在的红色坏死斑点，肺脏质地较硬似橡皮。肺脏、淋巴结、肾脏分子生物学PCR病名病原主要临床症状特征病理变化主要病料采集实验室诊断流行性腹泻PEDV水样腹泻，或者在腹泻之间有呕吐。呕吐多发生于吃食或吃奶后。一周龄内新生仔猪发生腹泻后3—4天，呈现严重脱水而死亡，死亡率可达50%，最高的死亡率达100%。小肠扩张，内充满黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿。粪便、肠内容物接种Vero细胞，分离病原，RT-PCR检测。传染性胃肠炎TGEV一般2周龄以内的仔猪感染后12-24小时会出现呕吐，继而出现严重的水样或糊状腹泻，粪便呈黄色，常夹有未消化的凝乳块，恶臭，仔猪明显脱水，发病2-7天死亡，死亡率达100%；在2-3周龄的仔猪，死亡率在0-10%。主要病变在胃和小肠，呈现充血、出血并含有未消化的小凝乳块，肠壁变薄。肠、肠内容物接种PK15细胞分离病毒，分子生物学RT-PCR病名病原主要临床症状特征病理变化主要病料采集实验室诊断口蹄疫FMDV猪口腔粘膜、鼻吻部、蹄部以及乳房皮肤发生水疱和溃烂为特征。不同年龄的猪易感程度不完全相同，一般是越年幼的仔猪发病率越高，病情越重，死亡率越高。仔猪心肌炎。水泡皮、水泡液、心脏、血清ELISA检测抗体猪流感SIV发病初期病猪体温突然升高至40.3～41.5℃，厌食或食欲废绝，极度虚弱，常卧地。呼吸急促、腹式呼吸、阵发性咳嗽。从眼和鼻流出粘液，鼻分泌物有时带血。病猪挤卧在一起，难以移动，触摸肌肉僵硬、疼痛，打嗝。剖检可见喉、气管充满含有气泡的黏液，黏膜充血，肺间质增宽，淋巴结肿大、充血，脾肿大，胃肠黏膜有卡他出血性炎症，胸腹腔、心包积液。肺、脾、淋巴结、血清、鼻拭子接种vero细胞、鸡胚分离病毒，分子生物学RT-PCR供病原学检查材料的采集、处理1、血液。前腔静脉或耳静脉采血。2、分泌物和渗出液：采集口腔、鼻腔、喉气管、泄殖腔和阴道分泌物时，通常是将棉棒插入天然孔反复旋转后蘸上分泌物，然后将样品端剪下。3、淋巴结、内脏器官、肌肉：淋巴结连带周围脂肪整体采集；内脏器官和肌肉，通常取病变最明显的部位。4、水疱皮：将病变部位清水清洗，剪取新鲜水疱皮3－5g放入灭菌小瓶内5、肠管：选取至少6cm肠管，两端结扎，从结扎线外端稍远端剪断。以上病料采集后，立即放入灭菌的玻璃容器，密封，外贴标签。做细菌学检查的，尽快冷藏。做病毒学检查的，尽快冷冻或参加病毒保护液。常用的病毒保护液：含抗生素的磷酸盐缓冲液、50%甘油磷酸盐缓冲液。供血清学检查材料的采集、处理〔1〕采血。用于制备血清的血液采出后不加抗凝剂，不进行脱纤处理。大中动物每头不少于5ml。〔2〕制备血清。采血时使血液直接流入试管，加塞，立即摆成斜面，待血液凝固后竖起试管，使血清自然析出。也可将血液离心别离血清。作血清学检测的血液，在采集、运送、制备血清过程中，均应防止震动和冻结，防止溶血，影响检测结果。〔3〕血清保存。制备的血清假设能在一周内检测，4℃冷藏，假设需保存较长时间，应于－30℃冻结。猪的前腔静脉采血方法猪只的固定。公母猪用保定绳固定，要求尽可能吊得高一点，使猪的头颈与水平面呈30度以上角度(如图1)，这样，即方便采血人员观察采血部位，又使前腔静脉向外突出，静脉血充胀。20kg以上的中大猪，由1-2个饲养员用捉猪器(或保定绳)拉住，头昂起，偏向右侧(如图2、3)；20kg以下的小猪，可由1-2个饲养员抓起，倒立，后背紧靠在栏架上(如图4)。图1公母猪保定图2中猪固定和采血图3大猪固定和采血图4小猪的保定与采血选取适宜的针筒和针头。根据经验，公母猪宜选用16#50mm针头(这种针头猪场不常用，但很多针头生产厂家都有生产，可以找兽医药械销售店联系购置)；30kg以上的中大猪，宜选用12#38mm针头；10-30kg小猪，可选用9#25mm(一次性注射器常配的针头)；10kg以下乳猪，应选择9#20mm针头(一次性注射器所配的另一种规格的针头)找准下针部位。猪的前腔静脉，越往头部越浅，但也越细；越靠胸部越粗，但越深。所以，采血应选择适当的部位。小猪取血的部位太靠前，血管太小，很难扎中，而且扎中了也很难抽到血液，所以，小猪的采血部位应稍靠后。中大猪和公母猪血管比较大，往后太深，针头够不到血管，所以，应略靠前。根据我们的经验，20kg以下的小猪应采两前肢与气管交汇处(如图4)，公母猪和20kg以上中大猪可选颈部最低凹处(如图2、3〕。下针和抽血。小猪：对准以上描述的部位，用针垂直刺入。拉紧针筒活塞，假设针头扎中前腔静脉，可见到血液自血管源源流出，抽取所需的血量即可。公母猪和中大猪：对准下针部位，使针头偏向气管约15o方向下针，拉紧针筒活塞，假设扎中，可见血液流出。如果见不至血液流出，说明没有扎中，有可能是前腔静脉较深，可用手顶紧针筒，使针头扎深一点。处理好