农杆菌介导甘蔗生长点遗传转化技术规程

2农杆菌介导甘蔗生长点遗传转化技术规程本文件确立了农杆菌介导甘蔗生长点遗传转化技术的程序，规定了外植体来源、试剂与溶液、仪器、设备和用具、培养基准备、无菌苗培养、转化用农杆菌液准备、遗传转化、转基因苗移栽阶段的要求。本文件适用于农杆菌介导甘蔗生长点遗传转化技术的操作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有规定的术语和定义。4外植体来源采集外植体的甘蔗应健康无病虫害，且是省级以上良种审（认）定的甘蔗品种。5仪器、设备和用具5.1仪器主要有：——可调移液器（0.2uL～10uL，10uL～200uL，100uL～1000uL，0.5mL～5mL)；——分析天平（精度0.1mg)；——纯水仪；——烧杯；——三角瓶；——培养瓶；——量筒；——离心管；——培养皿。5.2设备主要有：——超净工作台；——生化培养箱；——摇床；——冰箱；——高压灭菌锅；——液氮罐；——离心机。35.3用具主要有：——镊子；——手术刀；——接种针；——吸头；——无菌滤纸；——脱脂棉。6试剂与溶液6.1试验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，所有试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应用0.22um膜过滤除菌。6.2所使用的试剂及浓度、保存温度、英文名和缩写分别如下：——MS培养基：MScuLturemedium，常温保存；——蔗糖：Sucrose,30g/L，常温保存；——琼脂：Agar，6g/L，常温保存；——2,4-二氯苯氧乙酸：2,4-D，1mg/mL，4℃保存；——萘乙酸：NAA，1mg／mL，4℃保存；——6-苄基氨基嘌呤：6-BA，1mg／mL，4℃保存；——利福平：Rif，50mg／mL，-20℃保存3个月；——葡萄糖：GLucose，10mmL/L，常温保存；——果糖：Fructose，10mmL/L，常温保存；——乙酰丁香酮：Acetosyringone（AS），100um/L，-20℃保存；——头孢霉素：Cefradine（Cef），250mg/mL，-20℃保存。7培养基准备7.1培养基配制7.1.1MS培养基配制用电子天平称取12.52gMS培养基放入500mL三角瓶中，添加相应的激素，加蒸馏水定容至300mL，于高压灭菌锅121℃灭菌20min后于超净台分装至培养皿中，每皿倒25mL～30mL左右的培养基。培养基凝固后待用。需要配制的MS培养基pH为5.8，类型如下：——愈伤组织诱导培养基MS0：MS+3.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+6g/LAgar；——愈伤组织继代培养基MS1：MS+2.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+6g/LAgar；——愈伤组织分化培养基MS2：MS+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/LAgar；——壮苗培养基MS3：MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/LAgar；——生根培养基MS4：MS+4.0mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/LAgar。7.1.2MR培养基配制用电子天平称取2.09gMS培养基放入500mL三角瓶中，添加4mg/L的NAA，200μmoL/LAS，10mmoL/L果糖，10mmoL/L葡萄糖，加蒸馏水定容至100mL。7.1.3YEP培养基配制用电子天平称取10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g氯化钠，15g琼脂（液体培养基不加琼脂）放入1L量杯中，加入蒸馏水定容至1L,PH值7.0，混匀后分装至150mL的玻璃瓶中，每瓶装100mL，于高压灭菌锅121℃灭菌20min，备用。需要的溶液配制方法如下：4——2,4-D(1mg/mL)：称取100mg的2,4-D加入少量95％的酒精和1moL/L的NaOH使其溶解，再加灭菌蒸馏水定容至100mL即可用；——NAA（1mg／mL）：称100mgNAA干粉，用热的ddH2O定容至100mL，4℃保存备用；——6-BA（1mg／mL）：称100mg6-BA，先用少量的浓度为1M的NAOH预溶，随后用ddH2O定容至100mL，装在棕色瓶子中，4℃保存备用；——Rif（50mg／mL）：称取0.5gRif干粉，加入10mL二甲基亚砜，分装到无菌离心管中，用锡纸包住避光贬存于-20℃;——葡萄糖（10mmL/L）：取0.18g葡萄糖粉末，少量水溶解后定容至100mL；——果糖（10mmL/L）：取0.18g葡萄糖粉末，少量水溶解后定容至100mL；——乙酰丁香酮（AS，100um/L）：称取1.96g干粉，适量二甲基亚砜进行溶解后，加ddH2O定容至10ML，在超净台中用0.22um的滤膜过滤除菌，分装到无菌离必管中，-20℃保存；——头孢霉素（Cef，250mg/mL称25g头孢霉素干粉溶解于100mL水中，在超净工作台中0.22um的滤膜过滤除菌，分装到1.5mL的离心管中，存于-20℃。7.2培养基消毒培养基消毒步骤如下：a)将配好的培养基放入高压灭菌锅内消毒；b)121℃灭菌20min；c)待消毒室内的气压降至大气压时取出培养基，关闭电源开光；d)MS培养基应置于无风和干净的环境中冷却至40℃左右，后于超净台分装至培养皿中，每皿倒25mL～30mL左右的培养基。培养基凝固后待用；e)MR、YEP留存备用。7.3培养基储存培养基应尽量现配现用，也可在干净通风的环境中储存，但储存时间不宜超过1个月。8无菌苗培养8.1外植体采集、消毒与接种8.1.1采集田间采取无病虫害的健康甘蔗蔗稍，做好标记，剪掉叶片，留取30cm～40cm长的蔗稍带回实验室。8.1.2消毒在实验室材料处理间用75％乙醇消毒蔗稍表面，后带入无菌操作室。用75％乙醇消毒双手，取事先准备好的无菌纸放在超净台里备用。用75％乙醇泡过的脱脂棉擦拭蔗稍，每擦一次剥掉一层叶鞘，待剥掉4～5层叶鞘后放入超净台内的无菌滤纸上。用电热消毒器将医用剪刀、医用镊子、医用手术刀等接种工具消毒，消毒后应适当冷却，避免烫伤培养材料。8.1.3接种在超净台继续剥叶直到幼嫩的心叶组织。取距离生长点10cm左右的心叶组织在无菌滤纸上用医用手术刀把心叶切成0.2mm的薄片。用医用镊子把薄片插入含愈伤组织诱导培养基MS0的培养皿中，用封口膜把培养皿封好，防止污染。把培养皿放入培养箱中，26℃~28℃,24h黑暗培养，15d～20d转接1次，直到获得胚性愈伤组织。8.2增值培养定期将胚性愈伤组织转接至新鲜的MS1培养基中扩繁。8.3分化培养将生长状态良好的胚性愈伤组织在超净台上用镊子分成大小一致的小颗粒，转接至新鲜的MS2培养基中。把培养瓶放在温度为26℃~28℃的培养室内，光照强度宜为1500Lx～3000Lx，光照时间为每天516h左右。待愈伤组织分化出绿色丛芽，丛芽长至2cm～3cm高时分成单株转接至MS3培养基中壮苗培养，待苗长至4cm～5cm高时可以用于转化。9转化用农杆菌液准备9.1从-80℃冰箱取出EHA105农杆菌菌株，在含相应抗生素和利福平的YEP（细菌培养基）板上划线，28℃培养48h。9.2挑取部分单菌落接种到10mL含相应抗生素和利福平的YEP液体培养基中，温度为28℃,200rpm振荡培养至对数生长期。9.3取1mL菌液放入50mL含相应抗生素和利福平的YEP液体培养基中，温度为28℃,200rpm振荡培养至OD值为0.5～0.6，备用。9.4将菌液转到离心管中，温度为4℃,5000rpm离心5min～8min，弃上清，收集菌体。200rpm培养2h。10遗传转化10.1选取在壮苗培养基MS3上生长旺盛的甘蔗幼苗作为转化材料。10.2在超净工作台上用镊子分成单株,并用医用剪刀从距离根部1cm剪断，去掉上面带叶子的部分，留取含生长点在内的幼茎，幼茎为1cm的小茎段。10.3把小茎段转至培养瓶中，加入用200μmoL/LAS活化2h的农杆菌液，浸染约5min～10min，期间轻微振荡。10.45min～10min后用镊子取出，用无菌滤纸将菌液吸干后转入无菌水中清洗2～3次，后再用无菌纸吸干，转接到无抗生素的壮苗培养基MS3上，共