酶联免疫吸附试验双抗体夹心法

实验三（一）免疫标记技术

1、酶联免疫吸附试验（双抗体夹心法）

2、斑点免疫层析试验（二）免疫细胞的分离与纯化

1.密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（含淋巴细胞）（三）免疫细胞功能测定

1、E玫瑰花环试验（示教）

2、淋巴细胞转化试验（示教）（四）结核病相关的免疫试验简介（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）

待检标本阴性对照空白对照

（标准品稀释液100ul）“ELISA双抗体夹心法”，（第5-11步）第5步，最后5孔，加待检标本2孔、阴性对照1孔、空白对照（标准品稀释液）2孔，每孔100ul，37℃，30分钟：89

10

1112（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）“ELISA双抗体夹心法”，第5步，1-7孔加不同稀释度（浓度）TNF-α标准品，每孔100ul，37℃，30分钟：TNF-α100ul100稀释液

100100100100100100弃去100100ul100100100100TNF-α1000

500

250

12562.531.2515.625浓度(pg/ml)1

2345

6

7(倍比稀释)“ELISA双抗体夹心法”，第5步，1-7孔加不同浓度TNF-α标准品；后5孔加待检标本2孔、阴性对照1孔、空白对照（标准品稀释液）2孔；每孔100ul，37℃，30分钟：1.TNF

100μl1002稀释液

100100100

100

100

100弃去100100ul100100100100123456789101112100050025012562.531.2515.625TNF-α(pg/ml)①②③①待检标本

②阴性对照

③空白对照（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）

（一）免疫标记技术【概念或原理】：利用荧光素、酶、胶体金、发光物质以及放射性核素等易显示物（标记物）连接于已知抗体或抗原，再去检测待测标本中的相应抗原或抗体的量或其存在与否。优点：高度的敏感性和特异性，简便、快速，可作定性、定量或定位测定。【分类】

荧光免疫技术酶免疫技术→ELISA（双抗体夹心法

）放射免疫技术金免疫技术→斑点免疫层析试验化学发光免疫技术等

Ag＋Ab

荧光素Ag－Ab－荧光素＋Ab

荧光素（？）＋Ab－荧光素（洗涤）免疫标记技术举例：（细胞表面可见荧光）7cellswithfluorescencetuberclebacilluswithfluorescence9酶免疫技术酶免疫组化技术：组织或细胞中抗原定位酶免疫测定(如ELISA)：测液体标本中抗原或抗体ELISA

(酶联免疫吸附试验，enzyme-linkedimmunosorbentassay)

sandwichELISAtodetectAg√indirectELISAtodetectAb

competitiveELISAtodetectsmallAg

1）已知抗体包被

2）洗板

3）加待检抗原标本

4）洗板

5）加酶标记抗体

6）洗板

7）加底物显色，测定

(measurecolor)

11（显色）（不显色）（定量）(noAg

)

(Ag

)polystyreneSandwichELISA(todetectAg,双抗体夹心法，原理)（封闭的意义）（一）免疫标记技术

1、酶联免疫吸附试验(ELISA)

------双抗体夹心法请按照实验指导讲义方法进行操作,5-11步；第5、7步孵育时间由60min改为30min；第5步按下页PPT的图加样，加12个孔，37℃，30分钟，（实验课开始时已做，接着做第6步，洗板）结果，作标准曲线，计算待检标本TNF-α浓度“ELISA双抗体夹心法”，第5步，1-7孔加不同浓度TNF-α标准品；后5孔加待检标本2孔、阴性对照1孔、空白对照（标准品稀释液）2孔；每孔100ul，37℃，30分钟：1.TNF

100μl1002稀释液

100100100

100

100

100弃去100100ul100100100100123456789101112100050025012562.531.2515.625TNF-α(pg/ml)①②③①待检标本

②阴性对照

③空白对照（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）【材料】1.包被抗体McAb：抗TNF-α抗体。2.酶标抗体McAb：辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗TNF-α单克隆抗体。3.rhuTNF-α标准品：已知含量（1000pg/ml）的TNF-α标准品，使用时用标准品稀释液作倍比稀释成7个浓度：1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.625pg/ml4.待检标本：如血清、血浆、细胞培养上清等均可检测TNF-α。5.阴性对照：未免疫小鼠IgG。6.其它试剂：包被缓冲液（0.05molpH9.6碳酸盐缓冲液）；封闭液（1%牛血清白蛋白、0.14molNaCl、0.05molpH8.0Tris缓冲液）；标本稀释液（1%牛血清白蛋白、0.05%吐温-20、0.05molpH7.2PBS）；洗涤液（0.05%吐温-20、0.05molpH7.2PBS）；底物溶液邻苯二胺（OPD或四甲基联苯二胺（TMB）；终止液（2molH2SO4）。7．聚苯乙烯酶标板，塑料洗瓶或洗板机，酶标仪，微量移液器等。【方法】1.已知抗体包被酶标板：用包被缓冲液将包被抗体（抗TNF-α）稀释至工作浓度，按每孔100ul包被酶标板，4℃过夜。2.洗板：弃去酶标板内的包被抗体，在吸水纸上拍干，孔内加满洗涤液，静置2～3min，再在吸水纸上拍干，如此洗涤3次。有条件此步骤也可用洗板机进行操作。3.封闭：每孔加封闭液200ul，37℃湿盒1小时。4.

洗板：弃去封闭液，按步骤2洗板三次。5.加待检标本：1-7孔加不同浓度TNF-α标准品；后5孔加待检标本2孔、阴性对照1孔、空白对照（标准品稀释液）2孔；每孔100ul。37℃，30分钟。6.弃去酶标板内液体，按步骤2洗板三次。7.每孔(1至10孔)加100

l酶(HRP)标记抗TNF单克隆抗体，空白孔不加酶标抗体，置37℃孵育30min。8.弃去酶标板内液体，按步骤2洗板三次。9.每孔加底物溶液100

l，37℃避光孵育15min。10.每孔加终止液一滴（约50

l），终止反应。11.观察显色反应，酶标仪在490nm处测定每孔OD值。12.作标准曲线，计算待检标本TNF-α浓度。【线性关系式：log(concentration)=a*log(OD)+b】

concentration=a*OD+bTherelationshipbetweenconcentrationofTNF-αandODvalue,oneofthesetwo:1)

log(concentration)=a*log(OD)+b2)

concentration=a*OD+bDrawastandardcurveby

EXCEL

2007

(EXCEL2007绘制标准曲线步骤)

OpenadocumentofExcel2007.Inputthedata;

Choosecorrespondingdata;

algebraicexpressionofthestandardcurve:log(concentration)=a*log(OD)+bInsertInsertScatterChoosethe1sttypeofscattergraphChartlayoutsYouwillgetthescattergraphlikethis.Chartlayoutschoosetheninthonecontaining(fx)Youwillgetthestandardcurve&it'salgebraicexpressionlikethis.Thestandardcurveisobtained：

Relationshipbetweenconcentration&OD：log(concentration)=1.607*log(OD)+2.602.CalculatetheconcentrationofTNF-αinthetestsample,accordingtoaverage/meanODvalueofthe8th&9thwells.②Accordingtotherelationship,“concentration=a*OD+b”,choosecorrespondingdata;algebraicexpressionofthestandardcurve:concentration=a*OD+bAccordingtotherelationship,concentration=a*OD+b

Relationshipbetweenconcentration&OD：concentration=699*OD-166.9.CalculatetheconcentrationofTNF-αinthetestsample,accordingtoaverage/meanODvalueofthe8th&9thwells.TherelationshipbetweenconcentrationofTNF-αandODvalue,chooseoneofthesetwo:1)

log(concentration)=a*log(OD)+b2)

concentration=a*OD+bWhichoneisbetter?AccordingtothevalueofR2,highertheR2,betterthestandardcurve.The1stR2is0.933,the2ndR2is0.7.Sothe1stoneisbetter.Choosethe1stone.32A96-wellmicrotiterplate.ThisplatecouldbeusedforELISA

33(IndirectELISAtodetectAb)3435FIGURE6-10Variationsintheenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)technique,similartoRIAexceptusinganEnzyme(alkalineⓟ,horseradishperoxidase,&β-galactosidase):safer&lesscostly.todetectAb(HIV,HCV)todetectAgtodetectsmallAg6.ELISAexample:Instructiontotwocytokine-detectionkits(Materialsprovidedwiththekit,Assayprocedure,andsoon)附：细胞因子检测试剂盒使用说明书（英文或中文）MouseTumornecrosisfactorα

FORRESEARCHUSEONLY

Assayrange：25ng/L-800ng/L96determinationsPurposeThiskitallowsforthedeterminationofTNF-αconcentrationsinMouseserum,cellculturesupernatesａndotherbiologicalfluidsPrincipleoftheassayThekitassayMouseTNF-αlevelinthesample，usePurifiedMouseTNF-αantibodytocoatmicrotiterplatewells,makesolid-phaseantibody,thenaddTNF-αtowells,CombinedantibodywhichWithHRPlabeledgoatanti-mousebecomeantibody-antigen-enzyme-antibodycomplex,afterwashingCompletely,AddTMBsubstratesolution,TMBsubstratebecomesbluecolorAtHRPenzyme-catalyzed,reactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyatawavelengthof450nm.TheconcentrationofTNF-αinthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothestandardcurve.,,,,,,,Materialsprovidedwiththekit1washsolution20ml×1bottle7StoppSolution6ml×1bottle

2HRP-Conjugatereagent6ml×1bottle8Standard（1600ng/L）0.5ml×1bottle

3Microelisastripplate12well×8strips9Standarddiluent1.5ml×1bottle

4Samplediluent6ml×1bottle10Instruction1

5ChromogenSolutionA6ml×1bottle11Closureplatemembrane2

6ChromogenSolutionB6ml×1bottle12Sealedbags1

Specimenrequirements1.extractassoonaspossibleafterSpecimencollection,andaccordingtotherelevantliterature,ａndshouldbeexperimentassoonaspossibleaftertheextraction.Ifitcan’t,specimencanbekeptin-20℃topreserve,Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.2.Can’tdetectthesamplewhichcontainNaN3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.Assayprocedure1.DiluteOriginaldensityStandard:DiluteOriginaldensityStandardasfollowtable(serialtwofolddilution):800ng/L,400,200,100,50ng/L2.addsample：SetStandardwellsandblankwellsseparately（blankcomparisonwellsdon’taddsampleandHRP-Conjugatereagent,othereachstepoperationissame）.testingsamplewell.addSampledilution40μltotestingsamplewell,thenaddtestingsample10μl（samplefinaldilutionis5-fold）,addsampletowells,don’ttouchthewellwallasfaraspossible,andGentlymix.3.Incubate:AfterclosingplatewithClosureplatemembrane,incubatefor30minat37℃.4.Configurateliquid:30-foldwashsolutiondiluted30-fold（or20-fold）withdistilledwaterandreserve.5.washing：UncoverClosureplatemembrane,discardLiquid,drybyswing,addwashingbuffertoeverywell,stillfor30sthendrain,repeat5times,drybypat.6.addenzyme：AddHRP-Conjugatereagent50μltoeachwell,exceptblankwell.7.incubate：Operationwith3.8.washing：Operationwith5.9.color：AddChromogenSolutionA50ulandChromogenSolutionBtoeachwell,evadethelightpreservationfor15minat37℃10.Stopthereaction：AddStopSolution50μltoeachwell,Stopthereaction（thebluecolorchangetoyellowcolor）.11.assay：takeblankwellaszero

,Readabsorbanceat450nmafterAddingStopSolutionandwithin15min.CalculateTakethestandarddensityasthehorizontal,theODvalueforthevertical,drawthestandardcurveongraphpaper,FindoutthecorrespondingdensityaccordingtothesampleODvaluebytheSamplecurve,multipliedbythedilutionmultiple,orcalculatethestraightlineregressionequationofthestandardcurvewiththestandarddensityａndtheODvalue,withthesampleODvalueintheequation,calculatethesampledensity,multipliedbythedilutionfactor,theresultisthesampleactualdensity.Importantnotes1.Thekittakesoutfromtherefrigerationenvironmentshouldbebalanced15-30minutesintheroomtemperature,ELISAplatescoatedifhasnotuseupafteropened,theplateshouldbestoredinSealedbag.2.washingbufferwillCrystallizationseparation,itcanbeheatedthewaterhelpsdissolvewhendilute.Washingdoesnotaffecttheresult.3.addSamplewithsamplerEachstep,Andproofreaditsaccuracyfrequently,avoidstheexperimentalerror.addsamplewithin5min,ifthenumberofsampleismuch,recommendtouseVolley.4.ifthetestingmaterialcontentisexcessivelyhigher（ThesampleODisbiggerthanthefirststandardwell）,pleasediluteSample（n-fold）,Pleasediluenteandmultipliedbythedilutionfactor.（×n×5）.5.Closureplatemembraneonlylimitsthedisposableuse,toavoidcross-contamination.6.Thesubstrateevadethelightpreservation.7.Pleaseaccordingtouseinstructionstrictly,Thetestresultdeterminationmusttakethemicrotiterplatereaderasastandard.8.Allsamples,washingbufferａndeachkindofrejectshouldaccordingtoinfectivematerialprocess.9.Donotmixreagentswiththosefromotherlots.

Storageａndvalidity1．Storage：2-8℃.2．validity：sixmonths.anotherexample

Itisrecommendedtoplotastandardcurveforeachtest.1.Setpositive/negative,testsampleandcontrol(zero)wellsonthepre-coatedplaterespectively,andrecordtheirpositions.2.Aliquot50?lofthenegativeandpositivecontrolsintothesetwells.3.Add50?lofSamplediluentbufferintothecontrol(zero)well.

4.Add50?lofappropriatelydilutedsampleintothetestsamplewells.Addthesolutionatthebottomwithouttouchingthesidewalls.Shaketheplatetomixthecontents.5.Sealtheplatewithacoverandincubateat37°Cfor30min.6.Removethecoveranddiscardtheplatecontentbytappingtheplateonabsorbentfilterpapersorotherabsorbentmaterial.7.Discardthesolutionandwashtheplate5timeswithwashbuffer.DonotletthewellscompletelydryatanytimeManualWashing:Discardthesolutionwithouttouchingthesidewalls.Taptheplateonabsorbentfilterpapersorotherabsorbentmaterial.FilleachwellcompletelywithwashbufferandvortexmildlyonELISAshakerfor2’.Discardthecontentsandtaptheplateonabsorbentfilterpapersorotherabsorbentmaterial.Washtheplatefivetimes.AutomatedWashing:DiscardthesolutionandwashtheplatefivetimeswithWashbuffer(overfillingthewellswiththebuffer).Afterthefinalwashinverttheplateandtaponabsorbentfilterpapersorotherabsorbentmaterial.Itisrecommendedthatthewasherbesetforasoakingtimeof1min.NovaBiosLaboratoriesDiagnostics,Inc.1312E.ValenciaDriveAtlanticAve.95054CaliforniaUSAYellowfevervirusIgGELISAKit38.Add50μlofHRPconjugatedreagentintoeachwell(exceptcontrolwell).Addthesolutionatthebottomofeachwellwithouttouchingthesidewall.9.Sealtheplatewithacoverandincubateat37°Cfor30min.10.Removethecoverandwashtheplate5timeswithwashbuffer.11.Add50μlofTMB

SubstrateAintoeachwelland50μlofTMBSubstrateB,covertheplateandincubateat37°Cfor15min.Avoidexposuretolight.12.Add50μlofStopsolutionintoeachwellandmixthoroughly.Thecolorshouldchangetoyellowimmediately.13.ReadtheO.D.absorbanceat450nminamicroplatereader

within15minofaddingthestopsolution.Forcalculation,(therelativeO.D.450)=(theO.D.450ofeachwell)–(theO.D.450ofZerowell).ThestandardcurvecanbeplottedastherelativeO.D.450ofeachstandardsolution(Y)vs.therespectiveconcentrationofthestandardsolution(X).TheHumanYFV-IgGconcentrationofthesamplescanbeinterpolatedfromthestandardcurve.细胞因子检测试剂盒使用说明书（中文）羊肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围：50ng/L-1300ng/L使用目的：本试剂盒用于测定羊血清、血浆及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中羊肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。用纯化的羊肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α（TNF-α），再与HRP标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α（TNF-α）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中羊肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。试剂盒组成

130倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7终止液6ml×1瓶2酶标试剂6ml×1瓶8标准品（2400ng/L）0.5ml×1瓶3酶标包被板12孔×8条9标准品稀释液1.5ml×1瓶4样品稀释液6ml×1瓶10说明书1份

5显色剂A液6ml×1瓶11封板膜2张6显色剂B液6ml×1/瓶12密封袋1个

标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

1200ng/L5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液

600ng/L4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液

300ng/L3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液

150ng/L2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液

75ng/L1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。标准品（2400ng/L）

操作步骤1.标准品的稀释：2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度结果判断与分析：

<!--[if!supportLists]-->1、<!--[endif]-->仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值<!--[if!supportLists]-->2、<!--[endif]-->以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的SP标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的SP含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。<!--[if!supportLists]-->3、<!--[endif]-->检测值范围：0-100pg/ml<!--[if!supportLists]-->4、<!--[endif]-->敏感度：0.1pg/ml

注意事项1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．底物请避光保存。7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9．本试剂不同批号组分不得混用。10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。保存条件及有效期1．试剂盒保存：；2-8℃。2．有效期：6个月（一）2、斑点免疫层析试验

(dotgoldimmunochromatographicassay，DICA)the"rapidtests"thatyoumightusetodetectpregnancy,ordiagnoseaninfectionquicklyinadoctor'soffice.53BCTRA(Nitrocellulosemembrane)金标抗体（免疫金复合物）（小鼠IgG）（抗HCG）特异性抗原（HCG，绒毛膜促性腺激素）固相特异性抗体（抗HCG）固相抗小鼠IgG抗体liquidcapillaritycapillaryDefinitionofcapillarityplural

capillarities1:??thepropertyorstateofbeingcapillary2:??theactionbywhichthesurfaceofaliquidwhereitisincontactwithasolid(asinacapillarytube)iselevatedordepresseddependingontherelativeattractionofthemoleculesoftheliquidforeachotherandforthoseofthesolid

阳性：T区、R（或C）区均出现红色线条（两条红线）；阴性：T区不出现红色线条，仅R（或C）区出现红色线条（一条红线）。5657

positivenegativeinvalid（一）2、斑点免疫层析试验请按照实验指导讲义方法进行操作，并判断结果，

（二）免疫细胞的分离与纯化

1.

密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（含淋巴细胞）（二）1.外周血单个核细胞的分离

密度梯度离心法[原理]1）人外周血中红细胞、粒细胞密度1.092左右，单个核细胞为1.075~1.090。根据各类血细胞比重的差异，分离得到单个核细胞。2）外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，可进一步分离得到淋巴细胞。

离心前离心后抗凝血分离液血浆层单个核细胞层分离液红细胞、粒细胞（白色云雾状，薄层）Mainmethod:AnticoagulatedbloodarelayeredonthetopofFicoll(lymphocyteseparationmedium),horizontalcentrifugation,Fourlayers:plasma,lymphocytes,Ficoll,granulocytesandredbloodcells;(figure)Collectlymphocytes.62[方法]1.每桌（4人，2组）准备抗凝血1份（约4ml）；（已做，已稀释，用前混匀）2.将分层液（淋巴细胞分离液）加入试管；（已做）3.每组用吸管吸取肝素抗凝血约2ml缓慢加在淋巴细胞分离液之上（沿试管壁缓慢加入）；4.水平离心(2000rpm,20min)；[方法]5.将吸管轻插至淋巴细胞层，沿试管壁周缘轻轻吸取上下液界面间的单个核细胞层，置另一干净试管内；6.洗涤单个核细胞3次(加入约3mlHanks’液,混匀，1500或2000rpm,5min，倒去上清；重复2次)；7.用细胞培养液(或Hanks’液)重悬获得的单个核细胞，备用；8.加1滴台盼蓝染色；9.吸取单个核细胞混悬液，加一滴于载玻片上，显微镜下观察单个核细胞（以淋巴细胞为主）Lymphocytes(淋巴细胞)Lymphocytes,cancercells?淋巴细胞（淋巴癌？）normal

smalllymphocyteinbloodsmear(血片中淋巴细胞)lymphocyte

smalllymphocytes(cancercells)innon-Hodgkin’slymphoma小淋巴细胞（非霍奇金小淋巴细胞淋巴瘤）

（三）免疫细胞功能测定

1、E花环试验

原理：T细胞表面有绵羊红细胞受体（E受体）(CD2)，若T细胞与绵羊红细胞共同孵育，T细胞周围吸附绵羊红细胞，为花环形成细胞，

可用来鉴定和计数T细胞

＋＋T细胞SRBC花环形成细胞B细胞SRBC＋（60～80％）CD2E花环形成率=

形成E花环细胞数形成E花环细胞+未形成花环淋巴细胞×100%(60~80%)TcellsTcells+Bcells×100%

E花环形成率=

形成E花环细胞数形成E花环细胞数+未形成花环细胞数×100%总E花形成率：60~80%活性E花形成率：25~40%rosetteforming

cellT

cellrosetteforming

cellrosetteforming

cellsrosetteforming

cell(electronmicroscope)

显微镜下观察花环形成细胞，310室，不要求计算E花环形成率。

（三）2、淋巴细胞转化试验PHAT淋巴细胞（小细胞）淋巴母细胞

Tcell

lymphoblast(smallcell)(largecell)

BcellrestingBcell(smallcell)(Untransformed

lymphocytes)(transformedlymphocytes)(转化的淋巴细胞)(未转化的淋巴细胞)PHAPHA

转化率=

转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数×100%TcellsTcells+Bcells×100%（60~80%）核分裂相细胞过渡型细胞转化的淋巴细胞包括以下三种细胞：（1）淋巴母细胞：体积明显增大，为成熟淋巴细胞的3～4倍。核膜清晰，核染色质疏松，呈细网状。核内见明显核仁1～4。胞浆丰富，嗜碱性，有伪足样突出。胞浆内有时可见小空泡。（2）过渡型淋巴细胞：具有上述淋巴母细胞的某些特征。核质疏松，可见核仁，胞浆增多，嗜碱性强。体积比小淋巴细胞大。（3）核分裂相细胞：核呈有丝分裂，可见许多对成堆或散在的染色体。

Lymphoblast(typical,morphologicalfeatures):Lymphoblastsare12-20µmindiameterwitharoundtoovalnucleus,sometimeseccentricinlocation.Thenucleustocytoplasmratioisabout4:1andtheperipheryofboththenucleusandthecellmaybeirregular

inoutline.Thefine,highlydispersednuclearchromatinstainsalightreddish-purple,andoneortwopaleblueorcolorlesslargenucleoliarevisible.Thecytoplasmisusuallyagranularanddeeplytomoderatelybasophilic,withmarginal(peripheral)intensityacommoncharacteristic.(Smallrestinglymphocytesare6-8µmindiameter)85Small