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文档简介
主要内容:
一、酶的活性部位二、酶催化反应的独特性质三、影响酶催化效率的有关因素四、酶催化反应机制的实例五、酶活性的调节机制六、同工酶一、酶的活性部位与底物结合,并与催化作用直接有关,这个部位称酶的活性部位(actviesite)或活性中心(actviecenter)。组成酶活性中心的氨基酸侧链基团主要有Glu和Asp的-COOH,Lys的ε-NH2,His的咪唑基,Ser的-OH,Cys的-SH,Tyr的侧链基团。
结合部位(bindinggroup)
负责与底物的结合,决定酶的专一性酶活性中心
催化部位(catalyticgroup
)负责催化底物转变为产物,决定酶的催化能力。
一、酶的活性部位(一)酶活性部位的特点(1)活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分(1%~2%)(2)酶的活性部位是一个三维实体核糖核酸酶(124aa):His12、His119、Lys41溶菌酶(129aa):
Asp52、Glu35一、酶的活性部位(一)酶活性部位的特点(1)活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分(1%~2%)(2)酶的活性部位是一个三维实体(3)酶的活性部位与底物的识别的机制为诱导契合(inducedfit)机制(4)酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝内(5)底物通过次级键以较弱的力结合到酶上Ribonuclease:cleavesRNAEnzyme-substrate:hydrogenbonds一、酶的活性部位(一)酶活性部位的特点(1)活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分(1%~2%)(2)酶的活性部位是一个三维实体(3)酶的活性部位与底物的识别的机制为诱导契合(inducedfit)机制(4)酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝内(5)底物通过次级键以较弱的力结合到酶上(6)酶活性部位比整个酶分子更具有柔性或可运动性一、酶的活性部位(二)研究酶活性部位的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰法(1)非特异性共价修饰某些化学试剂能和酶分子中的氨基酸侧链基团反应而引起共价结合、氧化或还原的修饰反应,使氨基酸侧链基团的结构和性质发生改变。如果酶活力降低或丧失,则表明此基团可能是酶的必需基团,反之,酶活力不发生变化,说明该基团与酶的活性中心无关。(2)特异性共价修饰某一种化学试剂专一地修饰酶活性部位的某一氨基酸残基,使酶失活。通过水解分离标记的肽段,即可判断出被修饰的酶活性部位的氨基酸残基。DFP或DIFP(二异丙基氟磷酸)胰凝胶蛋白酶Structureofchymotrypsin(white)inacomplexwitheglinC(blueribbonstructure),atargetprotein.Theresiduesofthecatalytictriad(His57,Asp102,andSer195)arehighlighted.His57(blue)isflankedabovebyAsp102(red)andontherightbySer195(yellow).Thecatalyticsiteisfilledbyapeptidesegmentofeglin.NotehowcloseSer195istothepeptidethatwouldbecleavedinachymotrypsinreaction.一、酶的活性部位(3)亲和标记为了提高化学修饰剂对酶活性部位的专一性修饰作用,合成了一些与底物结构相似的共价修饰剂。共价修饰剂有两个特点:①可以较专一地引入酶的活性部位,接近底物结合位点。②具有活泼的化学基团可以与活性部位的某一基团结合形成稳定的共价键。TPCK(对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮)
TPCK修饰His,使His烷基化
底物为TPE(对甲苯氨酸-L-苯丙氨酸乙酯胰凝乳蛋白酶原、变性的胰凝乳蛋白酶都不与TPCK反应。一、酶的活性部位2.动力学参数测定法测定不同pH下的动力学参数,确定参与反应时酶分子侧链基团的解离状态,从而判断解离的氨基酸残基。采用此法,确定了RNase中的His12和His19参与催化反应。3.X射线晶体结构分析法4.定点诱变法二、酶催化反应的独特性质1.酶反应可分成两类第一类仅涉及电子的转移反应的速率为108s-1数量级第二类涉及到电子和质子两者或者其他基团的转移,反应的速率在103s-1数量级。大部分反应属第二类2.酶的催化作用是由氨基酸侧链上的功能基团和辅酶为媒介3.酶催化反应的最适pH范围通常是陕小的4.与底物相比,酶分子通常很大,而活性部位通常只比底物稍大一些5.除了具有进行催化反应所必需的活性基团外,还有其他特性基团三、影响酶催化效率的有关因素(一)底物和酶的邻近效应(approximation,proximity)与定向效应(orientation)邻近效应指酶与底物结合形成中间复合物以后,使底物和底物(如双分子反应)之间,酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大的提高,从而使反应速率大大增加的一种效应。定向效应指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。意义Page和Jencks认为,邻位效应与定向效应在双分子反应中起的促进作用至少可分别达104倍,两者共同作用则可使反应速率升高108倍。羧基和酯之间,自由度愈小,愈能使它们邻近,并有一定的取向,反应速率就愈大.对一个双分子反应来说,要使其中一个底物浓度达到103~108mol/L时,才能和分子内的反应速率相同,这样大的浓度实际上是办不到的.即使是纯水,水的浓度也不过是55mol/L。三、影响酶催化效率的有关因素(二)底物的形变(distortion)和诱导契合(inducedfit)(三)酸碱催化(acid-basecatalysis)
酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态,加速反应的一类催化机制。在水溶液中通过高反应性的质子和氢氧离子进行的催化称为专一的酸碱催化(specificacid-basecatalysis)或狭义的酸碱催化。而通过H+和OH-以及能提供H+及OH-的供体进行的催化称为总酸碱催化(generalacid-basecatalysis)或广义的酸碱催化。(三)酸碱催化(acid-basecatalysis)
(三)酸碱催化(acid-basecatalysis)
酸碱催化效率取决于总酸碱的解离常数(pK)。Brφnsted催化作用定律总酸催化作用logKa=CA-α(pKa)总碱催化作用logKb=CB-β(pKb)影响酸碱催化反应速率的因素有两个,即酸或碱的强度(pK值)及质子传递的速率。生理pH条件下His咪唑基可作为质子供体和受体,发挥重要作用。(四)共价催化(covalentcatalysis)
什么是共价催化?
在催化时,亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心,迅速形成不稳定的共价中间复合物,降低反应活化能,使反应加速。亲核催化共价催化
亲电子催化
丝氨酸羟基、半胱氨酸巯基和组氨酸咪唑基这些基团容易攻击底物的亲电中心,形成酶-底物共价结合的中间物。三、影响酶催化效率的有关因素(五)金属离子催化1.需要金属的酶分类(1)金属酶(metalloenzymes)含紧密结合的金属离子,多属于过渡金属离子如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或Co3+。(2)金属-激活酶(metal-activatedenzyme)含松散结合的金属离子,通常为碱和碱土金属离子。如Na+、K+、Mg2+和Ca2+。2.金属离子以3种途径参加催化过程(1)通过结合底物为反应定向(2)通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应(3)通过静电稳定或屏蔽负电荷三、影响酶催化效率的有关因素(六)多元催化协同效应在酶催化反应中,常常是几个基元催化反应配合在一起共同起作用。例如胰凝乳蛋白酶是通过Asp102、His57、Ser195形成的“电荷中继网”催化肽键水解,包括亲核催化和碱催化共同作用。多元催化协同作用的结果,是使酶反应加速的一个因素。(七)活性部位微环境的影响
胰凝乳蛋白酶催化芳香族氨基酸羧基构成的肽键疏水小袋疏水口袋肽链底物羧肽酶A裂解模式底物苯甲酰甘氨酰苯丙氨酸时形成疏水口袋四、酶催化反应机制的实例
(一)溶菌酶(Lysozyme)
1922年Fleming发现能溶解细胞的物质命名为lysozyme。眼泪是溶菌酶的一个丰富来源。但临床作用效果不佳。7年以后,Fleming发现高效抗生素-青霉素。溶菌酶存在于鸡蛋清及动物的眼泪中,生物学功能是催化细菌细胞壁多糖的水解。溶菌酶相对分子质量为14600,由129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质,含有4对二硫键。(一级结构见P395,图10-9)
亚历山大·弗莱明(AlexanderFleming),因发现了青霉素以及它对多种传染性疾病的治疗作用,荣获1945年诺贝尔生理学或医学奖。四、酶催化反应机制的实例
(一)溶菌酶(Lysozyme)
NAG:N-乙酰氨基葡糖NAM:N-乙酰氨基葡糖乳酸连键:β-1,4糖苷键四、酶催化反应机制的实例
(一)溶菌酶(Lysozyme)
溶菌酶分子近椭圆形,大小为4.5nmX3.0nmX3.0nm。它的构象比较复杂,α螺旋仅占25%,在分子的一些区域有伸展着的β片层构象。溶菌酶的分子内部几乎全部是非极性的.在溶菌酶分子的表面,有一个较深的裂缝,其大小恰好能容纳多糖底物的6个单糖,是溶菌酶的活性部位.
四、酶催化反应机制的实例
(一)溶菌酶(Lysozyme)
用大小不同的NAG寡聚体作底物测定被溶菌酶水解的相对速率,结果发现,少于4个糖的寡聚体水解速率甚小,当由四聚体增加到五聚体时,水解速率猛增500倍,五聚体增加到六聚体,速率增加近8倍,六聚体增加到八聚体,速率不再变化。这种情况与X射线晶体结构分析结果一致,活性部位所在的裂缝(cleft)正好被6个糖残基所装满。Glu35溶菌酶水解D-E之间的键Phillips提出溶菌酶的催化作用机制:(1)Glu35的—COOH提供一个H+到D环和E环间的糖苷键O原子上。H+的转移使D环的C1键与糖苷键O原子间的键断开,并形成正C离子过渡态中间产物。(2)有E及F残基的NAG二聚体离开酶分子。(3)正碳离子中间产物进一步与来自溶剂的OH-发生反应。Glu35质子化,由A、B、C和D残基组成的NAG四聚体通过扩散离开酶分子。(二)胰核糖核酸酶A(pancreaticribonucleaseA,RNaseA)
核糖核酸酶A是一种水解RNA的磷酸二酯酶,能专一性地切开嘧啶核苷酸3’P-O键,生成3’-嘧啶核苷酸或以3’-嘧啶核苷酸的寡聚核苷酸.(二)胰核糖核酸酶A(pancreaticribonucleaseA,RNaseA)
RNaseA的一级结构
124aa,含4对二硫键.只含一条多肽链.是被测定顺序的第二个蛋白质(第一个酶),Moore&Stein因此获1972年诺贝尔化学奖.RNaseA易分离纯化,可制成结晶.催化机制研究方法化学修饰法和动力学方法推测,X射线晶体结构证实.枯草杆菌蛋白酶水解为S20肽及S104蛋白.化学修饰法研究了RNaseA活性的必需氨基酸残基-碘乙酸处理RNaseA,推测His119和His12为酶活性中心的必需基团.(二)胰核糖核酸酶A(pancreaticribonucleaseA,RNaseA)
动力学分析得到证据证实His参与晶体结构证实了RNaseA的活性基团位置.Afoldin+proteinribonucleaseAPDB:7RSATheredballsrepresentwatersthatare‘bound’totheproteinbasedonpolarcontacts(三)羧肽酶A(carboxypeptidaseA,CpA)
羧肽酶A外肽酶,催化肽链C末端的肽键水解,对羧基末端芳香族或大的脂肪族侧链较为敏感,容易水解.
酶单独存在时:
蓝色:Tyr248黄色:Arg145绿色:Glu270酶底物复合物:
(1)二肽的Tyr侧链进入酶的疏水口袋,该口袋适合于芳香侧键和大的脂肪族侧链.(2)活性部位的Zn直接同断裂肽键羰基氧配位,该底物有效的置换预先占据此位置的水分子.酶底物复合物:
(3)Arg145(黄色)的胍基移动大约0.2nm,同底物末端羧基形成一个静电键,Glu270(绿色)与底物结合也经历了同样的位移.酶底物复合物:
(4)当底物的Tyr侧链与活性口袋结合时,至少有另外4个水分子从其中被置换出来.最大的构象变化是羧肽酶Tyr248(蓝色)的酚羟基移动了1.2nm,大约相当于这个蛋白分子直径1/4的距离.Tyr248的羟基从分子表面移到底物肽键附近,同底物敏感键N端侧链残基的氨基形成氢键.结果把活性部位的空腔关闭,并完成空腔由水充填的区域成为疏水区域的转化.(四)丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶是一类酶家族消化酶:胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、弹性蛋白酶(elastase)非消化酶:凝血酶(thrombin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、纤溶酶(plasmin)、组织纤溶酶原激活剂(tissueplasminogenactivator,tPA)等。消化酶先形成酶原。乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase)不是蛋白酶,是一种丝氨酸酯酶,但具有丝氨酶蛋白酶的相关机制,功能是降解神经递质乙酰胆碱。(四)丝氨酸蛋白酶消化作用的丝氨酸蛋白酶水解专一性差异:胰蛋白酶(碱性氨基酸Arg或Lys羰基侧链肽)、胰凝乳蛋白酶(芳香氨基酸Phe和Tyr羰基侧链肽)、弹性蛋白酶(水解小的中性氨基酸残基羰基侧链肽)大小:25000(MW)结构:一级结构和三级结构相似胰凝乳蛋白酶结构:紧密的椭球体,大小为5.1nm×4.0nm×4.0nm,C端含一个α螺旋(残基235-245)和几个β折叠域。多数芳香和疏水残基包埋在蛋白质内部,多数带电的或者亲水的残基分布在分子表面。(四)丝氨酸蛋白酶-胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)
His57、Asp102
、Ser195、在活性部位形成催化三联体(catalytgictriad)在没有底物时,His57是未质子化的,然而当Ser195羟基氧原子对底物进行亲核攻击时,它从Ser195接受一个质子,Asp102的COO-作用是稳定过渡态中His57的正电荷形式。Asp102定向His57并保证从Ser195接受一个质子处于适当的互变异构形式。形成酰化中间物
底物装进疏水口袋中。(四)丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶同源分析趋异进化(divergentevolution):基因突变,从同一个祖先取得不同的专一性。胰蛋白酶(碱性氨基酸Arg或Lys羰基侧链肽)、胰凝乳蛋白酶(芳香氨基酸Phe和Tyr羰基侧链肽)、弹性蛋白酶(水解小的中性氨基酸残基羰基侧链肽)趋同进化(convergentevolution):枯草杆菌蛋白酶与胰凝乳蛋白酶一样,催化三联体也由Asp、His、Ser残基组成。虽然来源不同,形成相似的催化机制,这种情况称为丝氨酸蛋白酶异源的趋同进化。(五)天冬氨酸蛋白酶(asparticproteases)
天冬氨酸蛋白酶是一类蛋白水解酶家族,产生于哺乳动物、霉菌和高等植物特性:酸性pH(有时中性)呈现活性,活性部位有两个Asp.消化酶:胃蛋白酶(pepsin)、凝乳酶(chymosin)溶酶体蛋白酶:组织蛋白酶D和E(cathepsinD&E)调节血压:肾素(renin):产生血管紧张肽,刺激平滑肌收缩和降低盐及体液分泌底物专一性:多种,通常断裂两个疏水氨基酸之间的肽键。大小:323-340aa,MW35000(五)天冬氨酸蛋白酶(asparticproteases)
结构:含两个相同的结构域。每个结构域由2个β折叠片和2个短的α螺旋构成。2个结构域通过6股反平行的β折叠片桥联起来。活性部位:是一个深宽的裂缝,是由2个并列的结构域形成的,大的足以容纳大约7个氨基酸残基。作用机制:广义酸-广义碱催化模式。与底物结合时,一个天冬氨酸羧基质子化,另一个脱质子。五、酶活性的调节机制
(一)别构调节(二)酶原的激活(三)可逆的共价修饰
(一)别构调控
别构调控概念1.别构调节酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变,进而改变酶活性状态。2.别构酶3.效应物4.正效应物5.负效应物
别构酶的作用动力学
1、正协同效应(positivecooperativeeffect)
2、负协同效应(negativecooperativeeffect)
3、正协同效应别构酶与米氏酶动力学比较
4、负协同效应别构酶与米氏酶动力学比较
怎么区分米氏酶与别构酶?koshland建议用饱和比值(saturationratio,Rs)典型的米氏酶RS=81具有正协同效应的别构酶RS<81具有负协同效应的别构酶RS>81
目前常使用Hill系数区分米氏酶与别构酶
Hill方程:
将Hill方程中的有关参数换成别构酶中的有关参数
n为Hill系数,米氏酶Hill系数n=1
正协同效应的别构酶n>1
负协同效应的别构酶n<1别构酶举例
1、大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶(E-Coli
aspartatetranscarbamylase,ATCase)(1)ATCase催化的化学反应和ATCase的动力学曲线
(2)ATCase活性调节的机理
有催化活性的构象无催化活性的构象2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶
(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的反应
(2)甘油醛-3-磷酸脱氢酶的调节机理
别构酶调节酶活性的机理
1、对称或协同模型(symmetryorconcertedmodel,也称齐变模型、MWC模型)1965年由Monod、Wym
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