一种建筑工程质量检测装置及其检测方法

(74)专利代理机构上海申浩律师事务所31280GO1N33/58(2006.01)1%磷酸酶抑制剂的裂解液，冷藏静置一定时间1/3页1/3页2加入含1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的裂解液，冷藏静置一定时间后，离心获取上冲体系内的TritonX-100和SDS;所述NP-40裂解液的主要成分为：Tris盐缓2/3页2/3页34 5[0002]磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3,GPC-3)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员之大小约为66kDa,该蛋白的其他别名包括DGSX,GTR2-2,MXR7,OCI-5,SDYS,SGB,SGBS,SGBS1等。GPC-3由蛋白质、糖和脂质共价连接形成复合物，主要通过糖磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定在细胞膜外表面，已知的信号肽位于1-25号氨基酸carcinoma.Gastroenterology2003;125(1):89-97),在肝癌的恶性进展中其表达水平逐疗效果均有临床意义。生物学功能研究表明GPC-3以自分泌/旁分泌的方式上调Wnt信号通恶性转化(HoM,KimH.Glypican-3:Anewtargetforcancerimmunotherapy.EurJ袭和转移等生物学行为。沉默GPC-3基因的转录可以抑制裸鼠移植瘤的生长(LiWanget.al,Glypican-3isabiomarkerandatherapeutictargetofhepatocellularcarcinoma,HepatobiliaryPancreatDisInt.2015A泛的灵敏度(56.8%～100%)和特异性(90%～100%),在低分化癌中具有更高的敏感性(TremosiniSetal.Prospective(glypican3,heatshockprofordiagnosisofveryearlyhepatocellularcarcinoma[J].Gut,2012,61(10):1481-品监督管理总局颁发的三类医疗器械注册证【注册号：国食药监械(准)字2014第34015026号】,已在临床推广应用。该试剂盒通过免疫组织化学方法检测术后组织样本GPC-3的表达，[0006]然而，该试剂盒只能检测术后组织样本或者有创性检查的活检组织样本，无法实现血液等体液组织的检测，且一次操作耗时较长，无创性和时效性难以保证。GPC-3蛋白表达主要存在于细胞胞浆内，有极少数GPC-3分泌至细胞外。现有针对血液GPC-3的检测方法为ELISA检测人外周血血清/血浆，其表现为表达率偏低，检出率低，灵敏度低，无法应用于[0007]为了实现血液中GPC-3的有效检测，专利号为CN111593024A的中国发明专利采用GPC3抗体结合免疫磁珠捕获GPC3阳性的CTC,提高肝癌分选效率。但该方法需要先对血样进将结合了GPC3抗体的磁微粒缓慢加入，分离捕获CTC;而后清洗磁球，采用和免疫荧光探针进行检测。尽管该方法一定程度上实现了以血液为检测基质实现肝癌诊断，但血液的预处[0008]本发明针对血液样本中GPC-3含量低，难以通过常规检测方法实现检测的问题进行，提供了血液样本中GPC-3复合物的富集及检测方法，还提供了用于检测血液样本中GPC-3含量的试剂盒。[0009]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：[0010]本发明第一方面，提供了血液样本中GPC-3复合物的富集方法，包含如下步骤：[0012]采集肝癌患者外周血置于抗凝管中，并混匀全血；[0014]加入多倍体积的红细胞裂解液，吹打混匀，冰上裂解一定时间后，离心弃红色上[0018]加PBS重悬细胞沉淀，取适量充池，静置2-3分钟，通过低倍镜四角4个大方格手工白细胞计数，计算公式如下：WBC/L=N/4*10⁵*104,并计算每毫升原悬液中的白细胞数量，WBC/ml原悬液=N/4*10**稀释倍数，当白细胞数量不低于107时，进入后续步骤；[0020]特异性磁珠抗体纯化分离获取目的CTC细胞，获取的细胞加入含1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的裂解液，冷藏静置一定时间后，离心获取上清液作为待检测样本，实[0022]红细胞裂解液与全血的体积比为6:1,吹打混匀，冰上裂解4～6min后，4℃、400g离心5min后弃红色上清。78实现GPC-3富集，富集后能够通过临床常用的化学发光检测模式或酶联免检测模式实现9[0059]图4为实施例1血样预处理样本采用酶联免疫检测模式进行检测时的标准曲线。[0060]下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明[0061]实施例血液样本中GPC-3富集及检测[0064]采集肝肿瘤患者外周血置于抗凝管中，并混匀全血[0068]洗涤沉淀1-2次，加入5倍体积的PBS或生理盐水重悬沉格手工白细胞计数，计算公式如下：WBC/L=N/4*10⁵*10⁴,并计算每毫升原悬液中的白细胞数量，WBC/ml原悬液=N/4*10**稀释倍数(10)=N/4*10⁵;[0072]特异性磁珠抗体纯化分离获取目的CTC细胞，获取的细胞加入含1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冷藏静置30min后，离心机4℃按照14000g、10min离心，获取上清液作为待检测样本，实现GPC-3富集。上清液利用BCA总蛋白检测试剂盒测定样本[0074]2.1化学发光检测模式建立[0075](1)GPC-3包被抗体按照5μg/mL浓度配制10mL,100μL/孔加入96孔白色高吸附化学[0077](3)按照150μL/孔加入封闭液(封闭液主要含有1%BSA或酪蛋白或鲑鱼精子、10%蔗糖或2%tween20等),室温放置2h;ml),按照100μL/孔加入制备好的[0081](7)100μL/孔加入生物素标记的抗GPC-3抗体工作液(2ug/ml),37℃反应60-90min,而后重复步骤6;还含有10%蔗糖或2%tween20等),室温放置2h;[0091](7)100μL/孔加入生物素标记的抗GPC-3抗体工作液(2μg/ml),37℃反应60-[0096]MAGTVRTACLVVAMLLSLDFPGQAQPPPVGEFFTDVSLYILGSDINVDDMVNELFDSLFPVIYTQLMNPGLPDSALDINECLRGARRDLKVFGNFPCN114813266A说明书7/10页[0105]采用化学发光检测法对实施例及对比例1和2中的标准品进行检测，各标准品的标准品浓度检测CLIA值实施例对比例1对比例205浓度(ng/mL)[0115]平行采取十个肝癌患者外周血，分别按照对比例1和对比例2所述方法进行处理样本编号123456789样本编号实施例检测CLIA值12349/10页56789[0123]表4与表3中的样本1～7、9存在重叠，相当于该八个样本分别经过实施例、对比例和2中的方法进行富集。对比可知，采用本发明方法进行血样样本富集预处理后，GPC-3富集效果增强效果明显，CLIA值达到对比例1的数倍甚至数十倍，是对比例2的3～10倍，效果差异显著。[0124]二、酶联免疫(ELISA)检测模式[0126]1.1标准曲线绘制[0127]采用酶联免疫检测法对标准品进行检测，各标准品的OD值结果如表5所示：[0128]表5实施例1标准品检测结果标准品浓度(ng/ml)05[0130]根据该结果绘制的标准曲线如图4所示。[0131]2、实施例与对比例对比[0132]平行采取十五个肝癌患者外周血，分别按照对比例1和实施例所述方法进行预处理后，采用酶联免疫检测法进行检测，结果如表6所示：[0133]表6对比例1及实施例样品检测结果对比样本编号血浆检测细胞裂解液检测<110>中国人民解放军海军军医大学第三附属医院<120>血液样本中GPC-3复合物的富集、检测方法及应用<130>权利要求书、说明书MetAlaGlyThrValArgThrAlaCysAspIleAsnGluCysLeGluLeuValAsnGl