赖氨酸产生菌的筛选与分离

赖氨酸产生菌筛选和分离学生姓名 专 业 学 院 2012年4月4日赖氨酸产生菌的筛选与分离一、 目的筛选出高产的优良菌株，以提高糖的转化率和发酵液中赖氨酸的累积浓度，缩短发酵时间，提高生产效率从而减少生产成本。二、 意义赖氨酸（Lysine）的化学名称为2,6—二氨基己酸，有L一型（左旋）、D—型（右旋）和DL型（消旋）三种旋光学异构体。人类和动物可吸收利用的只有L-型。L-型赖氨酸是人和动物营养的八种必需氨基酸之一，它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。由于其不能在人体内由还原氨基化作用或转氨基作用生成，必须由食物中摄取，因此赖氨酸有“特殊必须氨基酸”之称此外，赖氨酸在食品、医药以及生物饲料方面也占有极其重要的地位。近几年来，它的经济价值和社会效益日趋引起人们的重视，随着发酵科学的不断发展，提高赖氨酸发酵产酸收率的研究，成为迫切需要解决的问题之一。三、 国内外研究概况及现状L-赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法特点是工艺简单，但原料来源有限，仅适合小规模生产。后又出现了化学合成法、酶法，使用的合成法主要有荷兰的DMS（DutchStateMijinen）法和日本的东丽法，此法最大缺点是使用剧毒原料光气，可能残留催化剂，产品安全性差，存在严重的环保问题。1960年，日木首先采用微生物发酵法生产。微生物发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。氨基酸的L-型立体专一性决定了发酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷。我国于20世纪60年代中期开始进行赖氨酸菌株选育和发酵的研究，但因产量较低难以工业化。直到70年代末80年代初世界赖氨酸实现工业化后我国研究才取得突破。我国上海工业微生物研究所采用山芋淀粉为原料选育出的AU112菌种产酸率8%—10%。转化35%〜45%，提取收得率＞85%，发酵周期70h左右。复旦大学以黄色短杆菌FM84—415为出发株，用亚硝基胍进行诱变筛选出突变株，摇瓶发酵产生赖氨酸盐酸盐，产酸率达8.43%，糖转化率达44.9%。广东省微生物研究所选出的具有抗赖氨酸结构类似物和耐高糖等特性的棒状杆菌GM530突变株，经过14L〜5000L发酵罐实验证明，该菌遗传性状稳定，产酸率和转化率较高。我国科研人员还采用先进的生物技术应用于赖氨酸发酵生产。如用原生质体融合技术获得融合菌株，糖转化率提高8%,周期缩短11%。而将固定化细胞技术应用于赖氨酸生产，虽产酸率不高，但实行连续生产，对我国赖氨酸生产具有一定现实意义。目前，世界约2/3的赖氨酸企业采用发酵法生产，生产的为L-型赖氨酸，生产工艺已基本成熟。近年来，赖氨酸的需求逐年增加，全世界每年大概80万吨赖氨酸通过发酵生产的方式获得。用于工业上发酵生产赖氨酸的菌株主要是棒状杆菌和短杆菌等细的变异株？，棒状杆菌具有极高的经济价值，其中谷氨酸棒状杆菌应用最为广泛。此外，赖氨酸生产还有应用肠杆菌、黄色短杆菌、酿酒酵母、乳酸发酵短杆菌、假丝酵母等的报道。生产赖氨酸的微生物主要有四类：野生型、营养突变型、调节突变型和营养调节突变型。工业上通过优化发酵菌种（诱变和基因工程手段）和改变发酵条件（搅拌速度、pH、溶氧、温度和CO2）来提高赖氨酸产量。获得高产微生物菌株的方法主要有传统诱变方法（紫外线、X射线、氮芥和亚硝基酯等）、原生质体融合和基因工程方法等。据报道，经过诱变菌株产生的赖氨酸提高40%〜50%。诱变菌株以价格低廉的碳源为发酵原料，如各种淀粉水解糖、蜜糖、醋酸和乙醇等，发酵生产赖氨酸，通过分离、浓缩、蒸发、结晶、干燥生产工艺获得饲料级赖氨酸、再精制可得到食品级、医药级产品。四、方法原理由于赖氨酸具有旋光性，而生物所能利用的只有左旋（L）型，恰好微生物发酵所得的全部为L-型，因此利用发酵法生产赖氨酸是最重要的方法。发酵法还有一大优点是原料来源十分广泛易得，且价格便宜，如淀粉（木薯淀粉、玉米淀粉）、糖蜜（甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜等）。其原理是利用微生物的某些营养缺陷型菌株，通过代谢控制发酵，人为地改变和控制微生物的代谢途径来实现L-赖氨酸的生产。该法主要发酵原料是碳源。碳的种类很多，有糖蜜、葡萄糖、淀粉、薯干、醋酸、苯甲酸、乙醇和烃类等。但实际工业化的只有糖蜜、淀粉和醋酸等3种原料路线。用于发酵生产的菌株主要是棒状杆菌和短杆菌属等细菌的各种变异株。其诱变方法是以紫外线、X射线、氮芥和亚硝基胍等为主的处理方法。也有用细胞融合和基因工程等生物工程技术来育种。根据其表现类型可分为营养缺陷型、敏感型、类似耐药型（代谢调节变异）和组合型。五、实验步骤1、 出发菌株：乳酸发酵棒杆菌2、 培养基（1）基本培养基（MM）：葡萄糖0.5；硫酸铵0.15；尿素0.15；磷酸二氢钾0.3；硫酸镁0.01；生物素3pg；微量元素0.1mL;硫胺素20pg；氯化钙0.1mg；琼脂粉2.0；蒸馏水；pH7.0〜7.2；完全培养基(CM)：蛋白胨1.0；酵母膏0.5；葡萄糖0.5；氯化钠0.25；琼脂2.0；pH7.0〜7.2；种子培养基:葡萄糖1.5;硫酸铵0.4；硫酸镁0.04；玉米浆2.0；尿素0.1；碳酸钙2.0；NHAC0.2；KHPO・3H0 0.15；盐酸豆饼水解液0.86mL；pH7.0〜4 2 4 27.2；发酵培养基：葡萄糖1.5；硫酸按3.0；硫酸镁0.06；碳酸钙2.5；玉米浆2.5；NHAC0.9；KHPO.3H00.15生物素20》g；盐酸豆饼水解液1.6mL；pH7.2；4 2 4 23、试剂：磷酸缓冲液(pH6.0)、微量元素溶液硫酸锌8.8mg；钥酸按37mg；四硼酸钠88mg；硫酸铜270mg;二氯化锰7.2mg;三氯化铁970mg;蒸馏水1L配成.4、 方法：AEC最小抑菌浓度试验以乳酸发酵棒杆菌为出发菌株，取一环24h斜面培养物接种于肉汤培养基中(20ml/250nll三角瓶)，32°C摇床培养18h,离心，除去上清液，振荡使菌体分散用MM培养基洗涤三次后，制备成108菌悬液，再用液体MM培养基稀释1000倍,1〜10号试管中各加入1mL稀释后菌液1号试管中再加入AEC和苏氨酸混合，混匀，取1mL加入2号试管中，依次2倍稀释至9号试管，第10号管对照不加入AEC和苏氨酸混合液，32C培养观察.硫酸二乙醋和氯化锂复合诱变处理乳酸发酵棒杆菌株筛选高抗AEC突变株以乳酸发酵棒杆菌菌株为出发菌株，制成108/mL菌悬液，取4mL菌悬液加入装有16mLpH7.0磷酸缓冲液的三角瓶中，再加入1%硫酸二乙醋0.2mL，滴入95%乙醇10滴，32C水浴振荡处理50min后，立即加入25%硫代硫酸钠溶液0.5mL终止反应，将诱变后的菌液涂到含1%氯化锂的MM平板上，每个培养皿上放4个小钢杯，杯内分别加入不同浓度的AEC和苏氨酸混合液，32C培养48h，挑取抑菌圈内的抗性菌落于CM平板上培养24h，接斜面活化，上发酵进行初筛、复筛、获得一株产量较高的菌株•化的白腐菌点植接入平板，观察其生长情况及菌落特征。5、 L-赖氛酸含量则定方法：采用酸性茚三酮比色法测定。发酵液经离心(3000r/min)15min，取上清液1mL稀释至50mL，再吸1mL稀释液加入4mL茚三酮试剂于试管中沸水浴加热20min，冷却后，用722型分光光度计在478nn处比色