基因测序的原理及应用

基因测序的原理及应用遗传咨询培训-遗传检测一、基因测序的原理基因结构和基因序列、核酸分离纯化和保存、PCR技术和应用二、一代测序技术和临床应用一代测序技术、单基因遗传病的基因检测三、二代测序技术和临床应用二代测序技术、panel测序和全外显子组测序讲 课 大 纲一、基因测序的原理基因结构和基因序列、核酸分离纯化和保存、PCR技术和应用讲 课 大 纲大小：全长：3.2

×

109bp（3200Mb）基因序列占：1.2

×

109bp（1200Mb）基因间序列占：2.0

×

109bp

（2000Mb）基因平均长27kb，平均9个外显子/基因，编码序列平均1340bp/基因特点：编码序列仅占1%；非编码序列98%以上；重复序列多。目前，人类基因组中的蛋白质编码基因数目：20500个（ClampM.ProcNatlAcadSciUSA.2007Dec

4;104(49):19428-33）人类基因组的结构特点4真核生物基因结构CAAT

boxTATA

boxEnhancerpromoter调控序列调控序列exonexonPoly(A)加尾信号5

′+1Stop3

′结构基因intronintronexonTGAATGresponseelement5’-UTR转录DNARNA翻译蛋白质复制复制逆转录基因控制性状的两种途径：基因通过控制酶合成控制生物体的性状基因通过控制蛋白质的结构控制生物体的性状基因、环境与性状的关系生物性状是由基因与环境综合作用的结果中心法则及其发展酪氨酸黑色素酪氨酸酶控制酪氨酸酶的基因控制酶形成的基因异常酪氨酸酶合成异常黑色素形成障碍黑色素缺乏-白化病基因突变酶异常白化表型眼白化病-GPR143Type-1型-TYRType

2型-OCA2Type

4型-SLC45A2代谢异常基因突变导致疾病表型DNA的多态性(polymorphism)：某些DNA序列在人群中出现的频率>1%，有的与疾病相关基因的突变(mutation)：出现频率<<1%，引起基因功能的显著改变，导致人类遗传病或不致病人类DNA序列变异（variation）包括：8三类常见的DNA多态性（

frequency

>1%）变异类型概念基因组中的频率给定人群中基因组的给定位点的单个核苷酸变异，人群中出现的频率>1%基因组中约有1000万个SNPSTR可变数目为1-6bp核心单元组成的重复序列，长度一般<200bp基因组中至少有100万个，约占人DNA序列的3%CNV基因组中从≥1kbp到≥Mb不等的DNA片段的拷贝数变异，包括倒位、缺失、插入、重复等方式。人群中出现频率>1%时称拷贝数多态性目前尚不清楚，估计≥50kbp的CNV约占DNA序列的12%常见基因突变类型点突变动态突变

大片断突变同义突变错义突变剪接突变启动子突变无义突变移码突变缺失插入重排三联体重复扩增突变与蛋白活性的关系：遗传密码改变蛋白肽链中的片段缺失mRNA剪接错误影响mRNA修饰影响基因表达常见基因突变突变类型概念生物学效应点突变同义突变发生在三联密码子的第三位碱基仍编码相同的氨基酸错义突变涉及三联密码子前两位碱基中的一个氨基酸发生改变，可影响蛋白活性中心，也可无影响无义突变使编码氨基酸的密码变成终止密码子多肽链合成提前终止，通常产生无活性的多肽链剪接突变位于内含子与外显子交界处，可影响RNA剪接的突变降低剪接效率或产生异常剪接子，抑制正常基因表达启动子区突变突变位于基因调控元件结合处影响该基因的转录移码突变插入、缺失非三的整倍数的碱基突变位点以下的氨基酸序列发生改变，可使蛋白质失活或功能异常缺失缺失数十到数百个碱基对部分结构基因序列丢失造成编码基因序列重排，也可使整个基因缺如插入插入一段数十到数百个bp

DNA片段，可来源于同一染色体，也可来自其他染色体或外源基因若插入发生在结构基因，序列将发生重排，导致基因表达失活或激活插入位点附近的基因重排DNA缺失或插入引起，或由于基因扩增使基因序列发生大的改变通常可使基因表达产物剂量增加，导致细胞功能的紊乱 10DNA突变与基因功能的改变单倍剂量不足（haploinsufficiency）显性负效应（dominant negative）反义RNA转录/基因组修饰转录因子基因突变影响mRNA稳定性转录增强作用增强子的位置效应剂量效应SNP创造新启动子获得性RNA堆积基因测序的基本流程抽提核酸-扩增（建库）-测序-分析一代测序：抽提核酸-PCR扩增-电泳检测PCR产物-毛细管电泳（Sanger测序）-数据分析二代测序：抽提核酸-目标区域捕获-各种方式建库/扩增-各种平台大规模平行测序-数据分析两种方法的测序原理与数据分析不同细胞破碎沉淀核酸核酸提取抽提去蛋白质DNA为双链线性分子，在细胞中以与蛋白质结合的形式存在RNA为单链线性分子并具有不同的结构特点，如mRNA在3＇端有polyA结构分离核酸中应注意避免降解化学降解-酸碱环境物理降解- DNA的双链刚性生物降解：DNA酶抑制剂金属二价离子螯合剂-

EDTA-Na2抑制DNA酶活性（DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活）RNA酶（RNAase)抑制剂DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)RNase阻抑蛋白（RNasin）（可在样本中长期维持）血液基因组DNA抽提操作规程（QIAGEN）一、目的：保证抽提的血液基因组DNA质量，以满足后续实验的要求二、血液样本：外周静脉血

，EDTA抗凝剂（紫色管）三、所用试剂：QIAamp

DNA

Mini

Kit四、准备工作：首次实验前将试剂AW1，AW2中加入无水乙醇（体积见瓶上标注），并混匀。首次实验前将蛋白酶溶解于稀释液中（50人份试剂盒的蛋白酶中加入1.2ml稀释液，250人份试剂盒的蛋白酶中加入5.5ml稀释液）。

注：

稀释后的蛋白酶液能在2-8

C稳定保存2个月。如果试剂AL出现沉淀，放置56

C水浴使其溶解。具体操作步骤：1、200ul全血中加入20ul蛋白酶液，充分混匀（用于芯片分析的标本在加入蛋白酶液前，先加入RNA酶（100mg/ml）4ul）。2、加入200ulAL，涡旋15秒混匀。3、56

C水浴45分钟（间隔15分钟震荡混匀一次），短暂离心。4、加入200ul室温放置无水乙醇，涡旋15秒，短暂离心。5、标记离心柱，将上述混合液小心的加入柱中，8000

g离心2分钟。6、将离心柱放置于一干净的2ml收集管上，弃去盛有滤过液的收集管。加入400ul

AW1液，8000

g离心2分钟。7、弃去收集管中废液，重复步骤6（加入400ul

AW1液，8000转离心2分钟）。8、将离心柱放置于一干净的2ml收集管上，弃去盛有滤过液的收集管。加入400ul

AW2液，13000

g离心4分钟。9、弃去收集管中废液，重复步骤9（加入400ul

AW2液，13000

g离心4分钟）。10、弃去盛有滤过液的收集管，将离心柱放置于一干净的1.5ml离心管上（自备）。室温（15-25

C）开盖干燥15min。加入70ul

56度预热的AE，室温孵育5分钟，8000

g离心2分钟。11、将离心管中的AE吸出重新放入离心柱的膜中央，8000

g离心1分钟。12、测定收集管中DNA的浓度。记录260/280，260/230值。-20

C保存。PCR

(Polymerase

chain

reaction)

是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25-30个循环后，扩增倍数可达106-9。Dr.

Karry

Mullis

1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖；目的:

用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段PCR技术PCR的类型巢式PCR多重PCR不对称PCR共享引物PCR锚定PCR----

-原位PCR定量PCR彩色PCR重组PCRRT-PCR----

-PCR技术的主要用途目的基因的克隆;基因突变;DNA和RNA的微量分析;

DNA序列测定:

将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度基因突变分析:

PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性DNA序列分析常用技术一代测序技术及应用二代测序技术进展基因芯片技术：SNP和CNV分析1990 20002010测序技术的发展历史1950 1960 1970 1980DevelopmentofSangerSequencing(1977)Invention

ofAutomatedFluorescentSequencer(1985)Invention

ofCapillarySequencerInventionofApplied

BiosystemsSolid

System(2007)Invention

ofIlluminaGenomeAnalyzerSystem(2006)Invention

of454GS

20Sequencer(2005)chemicaldegradationmethodbyMaxam-Gilbertmethod(1977)ChemicaldegradationmethodbyWhitfield(1954)Invention

ofHeliscopesinglemolecularsequencerInventionofSinglemolecule

realtime(SMRT)DNAsequencingInvention

ofNanoporesinglemolecularsequencing(OxfordNanoporecorporation)一代测序：双脱氧末端终止法(Sanger

测序法)二代测序：合成测序法三代测序：单分子测序二、一代测序技术和临床应用一代测序技术、单基因遗传病的基因检测讲 课 大 纲一代测序（Sanger测序）1977年，英国人Frederick

Sanger

发现在DNA复制过程中掺入ddNTP，会产生一系列末端终止DNA链，能通过电泳按长度分辨。1980年获得诺贝尔化学奖Sanger测序技术PCR末端终止技术+毛细管电泳检测技术小片段PCR序列测定最高通量：小于4MB/天基于平板胶的测序技术96通道毛细管阵列一代测序结果的分析原始测序图专业分析软件点突变缺失插入剪切位点点突变Sanger测序仍然是目前测序的“金标准”相对于其他分型技术具有最高的准确性能检测新的突变适用于小突变检测和验证Alagille综合征(MIM118450)又称先天性肝内胆管发育不良征，是具有表型特征的慢性胆汁淤积的最常见原因，是一种累及多系统（肝脏、心脏、眼、颜面和骨骼等）的显性遗传性疾病。单倍剂量不足（haploinsufficiency）：JAG1基因：20p12.1，93%可发现点突变（/sites/GeneTests/）27Alagille

syndrome

(ALGS,

OMIM#

118450)-JAG1基因突变HGMD数据库（2014-03）已检测84例，其中病例为65例，39例发现突变（60%）Basedon92individualswithALGS[Emericketal1999]and117children

withALGS[Subramaniametal2011]-in

GeneTestsGenotype-Phenotype

CorrelationsNogenotype-phenotypecorrelationsexistbetweenclinicalmanifestationsofALGSandspecificJAG1mutationtypesorlocationwithinthe

gene.ThephenotypeofALGScausedbymutationsinJAG1isindistinguishablefromthephenotypecausedbymutationsinNOTCH2.NOTCH2mutationshadsignificantrenaldisease,oftenresultinginend-stage

renal.HeartismoresensitivetoJAG1dosagethanthe

liver.IndividualswithALGSwithmoresevereimpairmentmayhavealargerdeletionofchromosome20p12encompassingtheentireJAG1geneaswellasothergenesinthe

region.Pulmonic

Stenosis；Vascular

AnomaliesBrownSJ,McLeanWH.Oneremarkablemolecule:filaggrin.JInvest

Dermatol.2012Mar;132(3Pt

2):751-62Filaggrin

(FLG)基因-鱼鳞病的致病基因AkiyamaM.FLGmutationsinichthyosisvulgarisandatopiceczema:spectrumofmutationsandpopulationgenetics.BrJDermatol.2010

Mar;162(3):472-7.ReviewSanger测序临床应用实例糖原累积症1a型-GSDIa型葡萄糖-6-磷酸酯酶缺陷肝脏不能将糖原、乳酸、氨基酸分解成葡萄糖临床表现：低血糖、肝大、酸中毒、高脂血症、高尿酸血症、高乳酸血症、凝血功能障碍、发育迟缓等致病基因：G6PC，位于chr：17q21，全长13.6Kb，编码区5个外显子常染色体隐性遗传，男女发病几率均等88%患者可检测到该基因的突变已报道致病突变位点（CM980780，PMID:9700613）患儿，男，21天。因“肝功能异常一周余”入院查体：肝脏肿大实验室：肝功能异常，饥饿性低血糖，曾出现酸中毒，血乳酸偏高，空腹血脂偏高，血尿酸偏高G6PC：Exon

1：c.202G>A，p.G68R双向测序的必要性-排除假阳性实验室质控和室间质评LDT-需要详细的SOP实验室质控室间质评遗传咨询和产前诊断三、二代测序技术和临床应用二代测序技术、panel测序和全外显子组测序讲 课 大 纲二代测序技术（next-generation

sequencing

或deep

sequencing）单分子测序技术单分子实时测序，无需PCR扩增运行时间更短，读长达到5-50K，数据产出100-1000G；使人类基因组测序成本低于1000美元单细胞测序2008年，Ley等对一位50多岁急性骨髓性白血病(acutemyeloid

leukemia，

AML)患者，通过单细胞分析技术，测得每个肿瘤样本细胞拥有9个突变。--Nature 2008，456；66-722011年-Nature

Methods

将单细胞测序列为年度值得期待的技术之一--Science 25 May 2012: Vol. 336 no. 6084 pp. 976-9772013年-Science将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首高通量测序4343ACGTGGTAA

CGTATACAC

TAGGCCATAGTAATGGCG CACCCTTAGTGGCGTATA CATA…ACGTGGTAATGGCGTATACACCCTTAGGCCATAShortfragmentsofDNATT..TCAC..GCAC..GC TG..GTTC..CCCG..CAGA..GC

TG..ACCT..TGGT..GC AC..GC AC..GCTT..CCAA..GC AT..ATShortDNA

sequencesACGTGACCGGTACTGGTAACGTACACCTACGTGACCGGTACTGGTAACGTACGCCTACGTGACCGGTACTGGTAACGTATACACGTGACCGGTACTGGTAACGTACACCTACGTGACCGGTACTGGTAACGTACGCCTACGTGACCGGTACTGGTAACGTATACCTCT...Sequenced

genomeGenome44Sanger测序与高通量平行测序比较PolonySangerNext-generationsequencing

technology200520062007Birthday PrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-Ligation2010Semiconductor

SequencingPGM46afew

days2009:Illumina,Helicos40-50K$人类基因组测序Log10(price)20102005Year20001086422012:

100$,<24hrs2008:ABI

SOLiD60K$,2

weeks2010:

5K$,2007:

4541M$,3

months2001:

Celera100M$,3

years2001:

HumanGenomeProject2.7G$,11

yearsDNA打断并连接接头后，应用水包油颗粒捕获DNA。PCR扩增DNA片段，置于29

μm测序板中。应用焦磷酸反应方法进行序列测定454

测序仪,

FLX2005:300Mb/day,250bp,Eachrunin

7.5h.2008:XLR-HDkit,1G/day,450bp,eachrunin

10h.SOLEXA 测序仪单分子阵列测试，边合成边测序破碎DNA并加接头在有接头的小室内扩增靶DNA加不同颜色标记的核苷及DNA合成所需试剂根据颜色辨别序列每张芯片可测定1G49GenerationofPolonyarray:Bridge-PCR(Solexa)DNAfragmentsareattachedtoarray

andusedasPCR

templates50Sequencing:FluorescentlylabeledNucleotides

(Solexa)Complementarystrandelongation:DNA

Polymerase51测序通量成本比较Read

lengthSequencingTechnologyThroughput(per

run)Cost

(1mbp)*Sanger~800bpSanger400kbp500$454~400bpPolony500Mbp60$Solexa75bpPolony20Gbp2$SOLiD75bpPolony60Gbp2$Helicos30-35bpSinglemolecule25Gbp1$*Source:Shendure&Ji,NatBiotech,

2008454GSJunior：~35

MbpIonTorrentPersonalGenomeMachine

(PGM)：~60M~2

GbpProton:~10-15

GbpIlluminaMiSeq:~10

GbpNextSeq500:~100

Gbp小型二代测序仪（Benchtop

sequencers）二代测序技术流程GeneID:2737（case

B114）DNA

samplesSamplepreparationand

high-throughputsequencingRaw

ReSequencingdataRawdataprocessingSequence

mappingSequence

alignmentSNP

identificationSNP

functionannotationPublic

SNPdatabaseScoreSNPnsSNPof

interestExperimentinformation&Public

diseasedatabaseAssociation

Study数据分析流程基因测序对临床诊断的影响SaundersCJ.SciTranslMed.2012Oct

3;4(154):154ra13WGS技术快速诊断NICU患儿Candiadte

gene

based

Pipeline50 hrs TATGJB2基因突变:c.85_87del, p.Phe29delBCMWGLLaunchesClinicalExomeSequencingOct2011Over3000

samplesreceived,~2500cases

analyzed85%peds;15%

adultMostly

neurologicInaddition:skeletaldisorders,pulmonaryarteryhypertension,cardiovascular

dzVarietyofreferralsources–

academicmedical

centersN=3000~25%

+Dx; ESmolecularDxfitswithclinical

pictureGermlineCancer复旦儿科的工作-高通量测序数据分析流程建立59复旦流程60检测平台：质谱筛查：串联质谱-色谱-高效液相质谱细胞遗传：染色体、FISH、MLPA、aCGH基因测序：一代测序（Sanger）、二代测序质谱核型二代测序仪一代测序仪arrayCGH分子诊断和基因组研究平台分子基因诊断实验室2008年筹建2011年7月试运行2013年儿研所重组分子实验室、质谱室、新生儿筛查、细胞遗传临床医师

4人技术人员

7

人研发人员

5人临床多专科专家团队二代测序平台建设过程装机2012.4培训2012.5First

run2012.72012.12NMDHI2013.42013.8-102013.8-102013.8-10GSDPPHNEAIDP2014.1-2分析流程的筛选准确性研究63中国循证儿科杂志2015年2月第1期64形成产学研的重要基地国家卫计委批准的首批国家遗传病二代测序试点单位中国遗传学会认定的遗传咨询师培训基地复旦儿科-明码（上海）联合实验室复旦大学附属儿科医院儿童精准医学中心65检测技术20132015新增单基因测序4910253个MLPA等拷贝数分析51510个二代测序多基因panel01919个全外显子组测序（WES）0WES检测372例基因检测技术研发及应用临床应用典型案例：疑难危重病例诊断和临床干预IL10RA基因突变患儿表现顽固性类炎症性肠病（IBD），经脐血干细胞移植-国内年龄最小、体重最轻的患儿（6M），顺利康复Sanger

测序Ion

Torrent

平台NGS

:

一次对几十万到几百万条DNA分子进行测序实验平台结果比对波士顿儿童医院复旦儿科医院杨琳#,王慧君#.Ion Torrent PGMTM平台在儿童遗传性疾病诊断中应用初探.中国循证儿科杂志

2013;8(3):210-215已建立的部分二代panel项目名称检测指标项目名称检测指标新生儿遗传代谢病筛查89个基因胆汁淤积型肝病60个基因糖原累积症19个基因尿素循环障碍8个基因进行性肌营养不良DMD范可尼贫血3个基因神经纤维瘤3个基因结节性硬化TSC1，TSC2新生儿高胰岛素血症9个基因大疱表皮松懈症14个基因抗体缺陷病22个基因重症联合免疫缺陷41个基因马凡综合征4个基因自身炎症性疾病20个基因重症EBV感染和噬血相关基因15个基因多囊肾和肝纤维化5个基因肺遗传相关疾病17基因NOONAN综合征8个基因糖原累积病(glycogen

storage

disease，GSD)糖原累积病(glycogen

storage

disease，GSD)是一类由于先天性酶缺陷造成的糖原代谢障碍疾病,它可以出现机体能量代谢障碍和糖原异常堆积。多数属常染色体隐性遗传,少数属X连锁隐性遗传。GSD根据酶缺陷不同和糖原在体内沉积的部位不同分为

13型涉及与糖原合成、分解相关的十几个基因（已知）。其中Ⅰ、

Ⅲ、

Ⅳ、

Ⅵ、

Ⅸ型

以

肝

脏病变为主；

Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ型以肌肉组织受损为主

。临床以Ⅰ型最多见（25%），

Ⅰ型又可分为Ⅰa（G6PC1）和

Ⅰb型（SLC37A4）。临床分型困难。一代测序耗时、耗力、耗钱。GSD-panel:涉及19个基因。临床应用实例糖原累积病基因测序panel设计

GSD2Ampliseq

panel：

19gen