DB37-T 3531-2019 羊奶中羊、大豆源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法

67.100.01X

16

DB37

37/T

3531—2019羊奶中羊、大豆源性成分的定性检测方法实时荧光

PCR

法

of

，

and

derived

in

goat

fluorescent

PCR

发布

实施山东省市场监督管理局 发

布DB37/T

3531—2019 前言

................................................................................

II1

范围

...............................................................................

12

规范性引用文件

.....................................................................

13

术语和定义

.........................................................................

14

原理

...............................................................................

15

试剂和材料

.........................................................................

15.1

试剂

...........................................................................

25.2

材料

...........................................................................

26

仪器设备

...........................................................................

27

检测用引物和探针

...................................................................

38

试验步骤

...........................................................................

38.1

取样

...........................................................................

38.2

提取........................................................................

38.3

实时荧光

反应

...............................................................

39

试验数据处理

.......................................................................

49.1

有效性判定..................................................................

49.2

检测结果分析和表述

.............................................................

410

检测过程中防止交叉污染的措施

......................................................

4附

录 A

（规范性附录）

实时荧光定性

引物/探针序列、反应体系和结果判定

...........

5附

录 B

（资料性附录）

目的基因扩增靶标参考序列

....................................

7DB37/T

3531—2019 本标准按照GB/T

给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心。步迅。IIDB37/T

3531—2019

1范围本标准规定了羊奶产品中羊、大豆源性成分的实时荧光定性检测方法。本标准适用于生鲜羊奶、灭菌液态羊奶、羊奶粉等羊奶制品中羊、大豆源性成分的定性检测。本方法的检出限为

%。2 规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T

27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1羊源性本标准提及的羊源性成分为山羊和绵羊。3.2实时荧光 real-time

fluorescence

在PCR定量分析。3.3Ct值 cycle

threshold每个实时荧光反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理以山羊和绵羊线粒体LectinTaqMan实时荧光PCRPCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定羊和大豆的源性成分。5 试剂和材料DB37/T

3531—2019除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T

6682规定的一级水。5.1 试剂5.1.1

氯化钠（NaCl）。5.1.2

浓盐酸（）。5.1.3

三羟甲基氨基甲烷（Tris

base）。5.1.4

二水乙二胺四乙酸二钠（2EDTA·2H2O）。5.1.5

十二烷基硫酸钠（）。5.1.6

磷酸盐缓冲液（PBS）。5.1.7

异硫氰酸胍（GuSCN）。5.1.8

硅珠（silica）。5.1.9

蛋白酶冻干品。5.1.10

聚乙二醇辛基苯基醚（

X-100）。5.1.11

无水乙醇。5.1.12

Chelex-100

树脂。5.2 材料5.2.1 生理盐水：称取

0.85

g

氯化钠加

20

mL

水溶解，转移至

容量瓶中，加水定容至刻度，103.4

KPa

蒸汽压（121

℃）灭菌

，降至室温，4

℃保存备用。5.2.2 20

mg/mL

蛋白酶

K

溶液：称取

g

蛋白酶冻干品，转移至

mL

容量瓶中，加水定容至刻度，分装后于

℃保存。5.2.3 5

%的

Chelex-100：称取

5

g

Chelex-100

树脂，转移至

容量瓶中，加水定容至刻度。5.2.4 1

mol/L

Tris-HCl（pH

）溶液：称取

12.1

g

三羟甲基氨基甲烷置于

100

mL

烧杯中，加入80

mL

pH

至

6.4，转移至

100

mL

103.4

KPa

蒸汽压（121

℃）灭菌

，室温保存待用。5.2.5 0.5

mol/L

EDTA（pH

8.0）溶液：称取

18.61

g

二水乙二胺四乙酸二钠置于

100

烧杯中，加入

mL

水，用

%的氢氧化钠溶液，调节

pH

至

8.0，转移至

100

mL

容量瓶中，加水定容至刻度，103.4

KPa

蒸汽压（121

℃）灭菌

，室温保存待用。5.2.6 10

%

10

g

十二烷基硫酸钠溶解于

mL

无菌水中，转移至

容量瓶中，加水定容至刻度，储存于灭菌过的容器中待用。5.2.7 DNA

结合液：称取

60

g

异硫氰酸胍，加入

5

mL

1mol/L

（pH

6.4）溶液，再加入

8

0.5

mol/L

乙二胺四乙酸二钠（pH

8.0）溶液，再加入

4

mL

聚乙二醇辛基苯基醚原液（温度

60

℃），转移至

100

mL

容量瓶中，加水定容至刻度。5.2.8 TE

缓冲液：将

的

mmol/L

(pH

8.0)、

的

0.5

mol/L

乙二胺四乙酸二钠

8.0)

加入到

50

mL

的容量瓶中，调节

pH

至

8.0，转移至

50

容量瓶中，加水定容至刻度，103.4

KPa

蒸汽压（121

℃）灭菌

，降至室温，4

℃保存备用。6 仪器设备6.1

实时荧光定量

仪：4

通道以上。6.2

电子分析天平：感量

0.1

mg。6.3

离心机：最大离心力不小于

13

000

g。6.4

振荡型恒温金属浴：0

℃～100

℃。DB37/T

3531—20196.5

高压灭菌锅。6.6

低温冰箱：-20

℃～4

℃

。6.7

超净工作台。6.8

微量移液器：

µL～1

µL，

µL～

µL，2

µL～20

µL，

µL～

µL。6.9

容量瓶：10

mL，50

mL，

mL。7 检测用引物和探针内标引物探针序列及羊和大豆的引物和特异性探针序列见附录A中表A.1参见附录B。8 试验步骤8.1 取样首先收集白细胞：取液态羊奶2

mL，或者奶粉20

溶于2

ml无菌水中，每个样品设立2个平行样，将样品于4

℃、2

g离心30

；弃去离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加l

mL

pH

灭菌的缓冲液，将底部沉淀吹打悬浮并转移至1.5

mL的离心管中，离心力3

g，常温离心10

min，弃去上层液体，保留底部沉淀。8.2 DNA

提取8.2.1 向收集的白细胞中加入

µL

5

%的

Chelex-100

和

µL

20

mg/ml

蛋白酶

K，

℃保温

min以上；高速震荡

5

s～10

s，100

℃煮沸

8

5

s～10

s，13

g

离心

3

min，转移上清液至离心柱中，13

000

g

离心

1

8.2.2 向收集液体中加入

µL

硅珠悬浮液和

µL

结合液，充分混匀，65

℃水浴

min，中间反转

3～5

次；室温放置

5

，中间反转

3～5

次；4

000

g

离心

1

min，弃上清，留管底沉淀。8.2.3加入

µL

70

%

乙醇，于

8

g

离心

1

min，重复此步骤

2

次；加入

µL

无水乙醇；吹打悬浮，8

g

离心

1

min，弃上清。8.2.4 于

8

g

离心

30

s，吸走残余液体，室温干燥

min，使残余乙醇挥发干。8.2.5 加

100

µL

TE

缓冲液溶解

，加入

1

µL

RNA

酶溶液，55

℃水浴

5

，8

g，离心

1

min，吸取上清液转移至新的离心管中，

℃保存备用。8.2.6 紫外分光光度计检测提取的

DNA

浓度与纯度，测定

260

和

280

nm

处吸光值

A260280，比值在1.7～

之间，DNA

浓度约为

µL～

µL。8.3 实时荧光

反应8.3.1 试样实时荧光

检测多重实时荧光，反应体系中包含羊和大豆2个物种源性的特异探针，并加入内标质控体系。反应体系见附录A中表A.2。8.3.2 对照实时荧光

反应体系每个反应设置3次平行。在试样反应的同时，设置空白对照、阴性对照和阳性对照：a)

空白对照：以水作为空白对照；b)

阴性对照：以

2

个动物之外的其他基因组

DNA

为阴性对照；DB37/T

3531—2019c)

阳性对照：将羊和大豆

2

种动物和植物基因组

DNA

等量混匀作为阳性对照。8.3.3 实时荧光

反应体系配制按照附录A中表PCRPCR，3

000

g离心1

，取出管，放入荧光定量PCR仪中。8.3.4 实时荧光

反应程序95

℃预变性3

；95

℃

变性

s，62

℃退火延伸35

s，40个循环。9 试验数据处理9.1PCR

有效性判定空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明PCR体系有效：a)

和

ROX

Ct

值＞40.0，有

CY5

Ct

值≤35.0；b)

FAM

和

荧光的

S

值＞40.0

质控探针的荧光信号，且

Ct

值≤35.0；c)

阳性对照：有

、ROX

和

CY5

荧光信号的

S

型扩增曲线，且

Ct

值≤35.0。否则判定为PCR无效。9.2 检测结果分析和表述9.2.1 在

PCR

FAM、、

值≤35.0定样品中检出相应的羊或大豆源性成分；若无

S

型扩增曲线，则判定样品中未检出相应的源性成分。在

PCR

、、CY5

35.0＜Ct

值＜40.0需要加大模板量进行

PCR

反应。若再次扩增后的

Ct

值＜，则判定样品中检出相应的源性成分；若再次扩增后无

S

型扩增曲线，则判定样品中未检出相应的源性成分。9.2.2 对样品检测结果的判定，见附录

A

中表

。10 检测过程中防止交叉污染的措施防治污染的措施按GB/T

规定执行。5'-3'bpLectin-FCTCTACTCCACCCCCATCCACAT128Lectin-RAGAAAGAAGGCAAGCCCATCTGUNFAAGACGAGAAGACCGTATGGAG228UNRGATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTAIMFACCGTTACCGAGTCCAGGTG134IMRTTCGGACTCGATCAGAGCACGly-P5’FAM-CGCCGCTTCCTTCAACTTCACGCGGCG-3’DabcylY-P5’ROX-CCACCAAGGGATAACAACACTCTGGTGG-3’DabcylIACP5’CY5-CGACGGTCCTTTCTAATGTTGCGTCG-3’Dabcyl加量（μL）2×TaqManMaster

2×TaqManMaster

101×10×

Primer

UNF/

0.50

µmol/LLectinF/R0.50

µmol/LIMF/IMR0.25

µmol/L10×

Y-P(ROX)0.05

µmol/LGly-P(FAM)0.10

IMP(CY5)0.05

-310

～50

ddH2

20DB37/T

3531—2019AA附

录A（规范性附录）实时荧光定性

引物/探针序列、反应体系和结果判定A.1 实时荧光定性引物和探针序列实时荧光定性引物和探针序列见表A.1。表A.1 实时荧光定性

表A.1 实时荧光定性

引物和探针序列实时荧光定性引物和探针序列见表A.2。表A.2多重实时荧光表A.2多重实时荧光

反应体系对各种样品检测结果的判定见表A.3。

CtCt

源性

性成

检出大豆和羊源性成和羊

如果同时进行的阳性对照实验结果正常，检测实际

Ct35

①如果同时进行的阳性对照实验结果正常，则可能

DNA

②如果同时进行的阳性对照实验结果不正常，则可DB37/T

3531—2019表A.3表A.3实时荧光

定性检测方法各种实验结果的判定DB37/T

3531—2019BB附

录 B（资料性附录）目的基因扩增靶标参考序列B.1 大豆（Glycine

max）PCR产物序列（GenBank:NM_001354824.1）大豆（Glycine

max）PCR产物序列（GenBank:NM_001354824.1）CTCTACTCCACCCCCATCCACATTTGGGACAAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGCTTGCCTTCTTTCTB.2 山羊（Capra

hircus）产物序列（GenBank:KY523511.1）山羊（Capra

hircus）产物序列（GenBank:KY523511.1