疾病产生的分子基础课件

1第十一章疾病产生的分子根底Chapter11MolecularBasisofDiseasesDevelopment

2遗传病由一或几个基因及其编码产物蛋白质的异常导致；常见复杂疾病如恶性肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、心脑血管、高血压等发生和开展都涉及到更多蛋白质及其复合物的结构、功能和相互作用异常。疾病的本质是蛋白质功能紊乱，根本原理是各种原因引起蛋白质质和量的改变。3

1.基因结构的改变；2.受细胞内调节因素或其它因素影响使基因的表达发生改变；3.外来的致病基因；4.蛋白质翻译后加工及蛋白质降解发生变化。蛋白质功能紊乱的原因各不相同，具有不同分子机制。4第一节基因结构改变与疾病

第二节细胞间信号异常与疾病第三节

细胞内因素与疾病第四节

翻译后加工运输障碍与疾病第五节

蛋白质降解异常与疾病第六节病原微生物基因引起的疾病第七节

疾病分子机制的研究策略5第一节基因结构改变与疾病一、基因突变二、基因突变的遗传学效应三、结构基因变异导致的疾病四、调控序列变异导致基因表达水平变化6自发性复制错误碱基脱落或局部脱落活性氧簇〔ROS〕物理因素紫外线电离辐射化学因素烷化剂碱基类似物修饰剂DNADNA突变的原因病原生物基因的整合7一、基因突变的多种类型点突变是单个碱基的替换：转换和颠换缺失是一个或多个核苷酸的丧失插入是一个或多个核苷酸的增加倒位是一段核苷酸序列染色体位置的改变基因突变还分为配子突变与体细胞突变动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变8例脆性X综合征“CCG〞重复发生在FMR1〔脆性X智力低下基因1〕的5´非翻译区，拷贝数不稳定。8~50拷贝(正常人)52~200拷贝(携带者)200~1000拷贝(患者)9强直性肌营养不良3´非翻译区CTG拷贝数过度增加；Huntington舞蹈病编码区CAG拷贝数过度增加；Friedreich共济失调症内含子CAA拷贝数过度增加。101.错义突变〔missensemutation〕指DNA改变后mRNA中相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，使蛋白质中的氨基酸发生改变。二、不同的基因突变引起不同的遗传效应

有些错义突变不影响蛋白质或酶的生物活性，不表现出明显的表型效应。112.无义突变(nonsensemutation)亮氨酸的密码子UUA，中间的U变为A这样一个碱基变化就会成为〔终止密码子〕UAA。酪氨酸的密码子是UAC，置换突变使UAC变为密码子UAG后翻译便终止。UAG、UGA、UAA终止密码子123.同义突变(synonymousmutation)：同义密码子互换性变化,所编码的氨基酸不变。例如：CUU

CUC

CUG→亮氨酸13

4.移码突变(frame-shiftmutation)1)密码子缺失或插入

2)整个基因或基因大片段缺失

14a.密码子缺失或插入CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTLeuThrProGluGluLysSerCTGACTGAGGAGAAGTCTLeuThrGluGluLysSerCTGACTCCGGAGAAGTCT

LeuThrProGluLysSerCCTCCTGAGGAGAAGTCT

ProProGluGluLysSer15b.阅读框改变CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTLeuThrProGluGluLysSer

TGACTCCTGAGGAGAAGTCT

TGACTCCTGAGGAGAAGTCTCTACTCCTGAGGAGAAGTCTCTACTCCTGAGGAGAAGTCT

LeuLeuLeuArgArgSer

插入或缺失带来的无义突变CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTLeuThrProGluGluLysSer165.融合突变(fusionmutation)

细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基因间错位配对,产生两种含不同等位基因的染色体。171819白血病中局部常见的融合基因206.基因突变影响hnRNA的剪接

基因突变发生在hnRNA的一级结构上特定的剪接位点上，形成新的剪接位点或使正常剪接位点消失，导致hnRNA的剪接错误，产生异常的mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。21真核生物基因的剪接位点：由内含子的5′端“GT〞和3′端“AG〞，及内含子和外显子内的其它调控元件共同决定。EXON1INTRON1EXON2EXON1EXON2EXON1INTRON1EXON2hnRNASplicing?YesNo22例：家族性孤立性生长激素缺乏Ⅱ型遗传病由于GH-1基因的EXONⅢ上第5nt由G→A，破坏一个ESE，使EXONⅢ被跳过，而最终造成编码蛋白缩短，影响功能。23转入了人缺陷型的GH-1基因利用RNAi使导入基因沉默2007年24三结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病结构基因发生改变会改变蛋白质的一级结构，进而改变蛋白质的理化性质。251.蛋白质结构变化引起的疾病〔1〕血红蛋白病(hemoglobinopathy)26血红蛋白结构血红蛋白是由4条肽链〔两个α和两个β链〕组成的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链，都结合一个血红素。27血红蛋白病——镰刀形细胞贫血症2829基因突变类型异常Hb氨基酸变化临床特征错义突变HbShuangfengα27Glu→Lys(GAG→AAG)不稳定Hb病HbSβ6Glu→Val(GAG→GUG)镰刀型细胞贫血HbBibbaα136Leu→Pro(CUG→CCA)不稳定Hb病无义突变HbMckeesRocksβ145Tyr→终止(UAU→UAA)不稳定Hb病终止密码突变HbConstantSpringα142UAA→CAA(延长：142Gln173)α-地贫血红蛋白病分子根底30基因突变类型异常Hb氨基酸变化临床特征密码子缺失HbGunHillβ91～95缺失不稳定Hb病密码子插入HbGradyα118与119间插入3个氨基酸无明显症状移码突变HbTakβ147UAA→ACUAA延长：Thr158UAA不稳定Hb病融合突变HbLepore-Bostonδ87(Gln)-β116(His)β-地贫HbKenyaγ81(Leu)-β86(Ala)β-地贫血红蛋白病分子根底31〔2〕家族性高胆固醇血症LDL受体基因变异，导致其编码蛋白结构异常，功能下降或完全丧失。配体结合结构域，由LDL受体蛋白N端292个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸。该结构中有7个由40个氨基酸残基组成的重复序列(天冬-半胱-X-天冬-甘-丝-天冬-谷)，每个重复序列中含有6个半胱氨酸残基，全部42个半胱氨酸。322.蛋白质合成量变化引起的疾病33人珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构34

珠蛋白基因的表达在时空上受到遗传因素的精确调控，表现为以下特点：组织特异性发育阶段特异性协同性35α-地贫基因缺失类型α1α2正常根本正常αααα+轻度贫血α+α+轻度贫血αα0高度贫血α+α0HbBart’s综合征α0α036β珠蛋白结构基因突变抑制β珠蛋白合成使β珠蛋白量减少甚至完全缺失,引起β-地贫第17位赖氨酸密码子AAG(Lys)→TAG,发生无义突变,引起β0地贫;β珠蛋白基因的编码顺序内插入或缺失1、２、４或７个核苷酸，会使突变点以后的读码框遭到破坏，往往造成β-珠蛋白肽链合成提前终止，而引起β0地贫。37四、调控序列变异导致基因表达水平变化

顺式作用元件的基因突变，会降低β珠蛋白基因的转录，使β珠蛋白合成减少，引起β+-地贫。TATA盒：-32〔C→A)、-30(T→C)、-29(A→G)、-28(A→G)。CAAT盒：-101、-92、-88、-87、-86等位点的点突变。CAATTATACAPPolyA尾130311041051465′3′IVSⅠIVSⅡIS38启动子和外显子1之间大于10kb的缺失;另一种是启动子和外显子1之间大于6kb的缺失。两种突变都使LDL受体基因的表达能力完全丧失。LDL受体启动子变异39一些内含子的变异也会影响蛋白质的合成，使体内相应蛋白质含量减少或缺失。ApoB100基因内含子的第一个碱基会发生G→T突变，突变基因转录后生产的hnRNA，会影响ApoB100mRNA的正常剪切。40第二节细胞间信号异常导致基因

表达异常引起疾病

细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，协调调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。41AFP接受异常细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素胚胎发育过程中,AFP增强子激活,出生后,AFP寂静子处于活化状态。在异常细胞增殖信号的作用下,c-myc、c-fos、c-jun等癌基因表达异常增加,其表达产物与AFP基因顺式作用元件结合,激活AFP基因表达。AFP与其膜受体结合，影响TNF及其受体表达，导致肝癌细胞逃防止疫监视，并促进其生长。42粉尘刺激→肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞→分泌TGF-β1→成纤维细胞→促细胞分裂和ECM蛋白基因表达→ECM蛋白成份合成和分泌增加〔各型胶原蛋白、IL-1、TNF等〕→ECM病理性蓄积，矽肺发生尘肺：长期吸入大量含游离二氧化硅粉尘引起的以肺纤维化为主要病变的疾病43第三节细胞内因素导致基因

表达异常引起疾病异常的细胞内信号持续高血糖引起的糖尿病心肌病高血糖→DAG↑→⊕PKC→⊕ACE→AngⅡ↑→心肌重塑、心肌肥大。44异常的DNA甲基化〔不同的DNA甲基化模式形成不同的表观遗传特征〕hCG5´转录起始区低甲基化→非滋养层细胞hCG↑→受体结合→⊕cAMP→Tumor↑45ProteinscomplexedwithDNAallowformore“open〞structure;canbetranscribed….Methylationleadstochangeinchromatinstructure;morecondensedstateistranscriptionallyinactive…genesare“off〞…46人绒毛膜促性腺激素(hCG)在妊娠早期维持黄体功能、促进妊娠进行和胎儿性别分化等；肿瘤细胞中，hCG基因5’转录起始区发生去甲基化或低甲基化，形成非滋养层细胞中异位表达，具有类似与生长因子作用，激活cAMP旁路信号途径，独立地调节肿瘤细胞增殖、分化和生长。47第四节

翻译后加工运输障碍与疾病新合成的蛋白质翻译后加工主要过程：去信号肽、基团修饰、折叠、亚基聚合、运输〔至靶作用部位〕等48

白化Albinism

49酪氨酸酶与Ⅰ型泛素性白化病酪氨酸酶催化结构域点突变可以使酪氨酸酶的活性降低甚至消失,黑色素合成减少或不能合成,导致Ⅰ型泛素性白化病;酪氨酸酶催化结构域以外的点突变也能导致色素缺失,蛋白质不能正确折叠.没有正常折叠的酪氨酸酶不能从内质网输出而滞留在内质网,无法完成其成熟及运输过程。50蛋白转运异常酪氨酸酶P蛋白高尔基体黑色素体P蛋白基因突变黑色素合成障碍引起Ⅱ型泛发性白化病内质网酪氨酸酶与Ⅰ型泛素性白化病51第五节

蛋白质降解异常与疾病52蛋白质降解途径

溶酶体：降解细胞吞入的胞外蛋白质泛素-蛋白酶体：降解胞内泛素化的蛋白质泛素(ubiquitin,Ub)

E1(泛素激活酶)E2(泛素结合酶),

E3(泛素连接酶)

26S蛋白酶体(proteasome)

蛋白的降解5354泛素-蛋白酶体系统活性被异常抑制或激活均可导致机体紊乱。2004年诺贝尔化学奖阿龙·切哈诺沃(Aaron

Ciechanover)阿夫拉姆·赫什科(Avram

Hershko)欧文·罗斯(Irwin

Rose)55高血脂:载脂蛋白的过度降解载脂蛋白〔apolipoprotein,apo):与脂质结合的运输载体泛素-蛋白酶体系统在维持正常载脂蛋白含量中起到重要的作用，该系统功能障碍，会导致载脂蛋白含量异常。ApoAⅠ,ApoB100,ApoE,etc.56阿尔茨海默病:蛋白酶体活性的抑制阿尔茨海默病〔Alzheimer’sdisease,AD〕是一种中枢神经系统退行性病变的疾病。临床上首先表现为近期记忆力降低,继而表现持续性智能衰退、失语、判断推理能力丧失,以及运动障碍等。AD最显著的神经病理组织学特征是老年斑和神经原纤维缠结。现已发现,β-淀粉样蛋白在老年斑的形成过程中起十分重要的作用。57第六节病原微生物基因引起的疾病感染引起机械或生物学损伤；争夺营养造成营养缺乏；毒素引起细胞代谢功能异常；基因整合到宿主基因组，造成基因结构改变和表达异常。58第七节基因结构和表达与疾病的研究策略1.通过基因结构分析确定基因变异

2.基因表达水平分析差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析59测序：双脱氧自动化序列分析SSCP：单链构象多态性分析RFLP：限制性酶切长度多态性DNA芯片AS-PCR:等位特异性PCRASO杂交：寡核苷酸斑点杂交MS-PCR：甲基化PCRDGGEetc.一、基因结构分析60根本原理:在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，即可确定错配的位置。1.核糖核酸酶切分析〔RNasecleavage〕61GCATACGTAT野生型5´3´3´5´突变型GCTTACGAAT3´3´5´5´异源杂合双链酶切GCAUACGTAT3´5´3´5´3´5´3´5´GCAUACGAAT？体外合成RNA探针GCAUA5´3´野生型探针162GCATACGTAT野生型5´3´3´5´突变型GCTTACGAAT3´3´5´5´异源杂合双链酶切TATGCATACG3´5´3´5´3´5´3´5´TATGCATTCG体外合成RNA探针TATGC5´3´野生型探针263未发生酶切发生酶切电泳别离64缺点：当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；分析DNA的一条链，突变检出率为30%；同时分析DNA的两条链，突变检出率为70%；需要制备特异性的RNA探针652.杂合双链分析法

〔heteroduplexanalysis,HA〕直接在非变性凝胶上别离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率。66杂合双链分析〔heteroduplexesanalysis〕非变性胶电泳5′5′GCTACGAT缺失突变型GCATACGTAT野生型5′3′3′5′3′3′野生型DNA探针与野生型DNA杂交GCATACGTATTATGCATACG5′5′3′3′5′5′3′3′形成异源杂合双链野生型DNA探针与缺失型DNA杂交TATGCATCGCGATGCATA5′3′3′5′5′3′3′5′67缺点：只适合200～300bp的片段;不能确定突变的具体位置;检出率一般只有80%左右。683.化学切割错配法

〔Chemicalcleavageofmismatch,CCM〕69特点：突变检出率高；如使用荧光检测系统，灵敏度较高；可检测长度达2Kb的核酸片段；步骤多、费时、有毒；704.酶促切割错配(enzymemismatchcleavage)酶：T4内切核酸酶VII识别的序列：DNA:DNA异源杂合分子优点：最长检测片段可达1.5kb，省去体外合成RNA探针的步骤缺点：会产生非特异性切割，对错配位点的识别也不是100%71二、基因表达水平分析72在不同的生长时期、在个体发育与分化不同阶段、在生物体对疾病的反响以及不同环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因的差异表达〔differentialexpression〕。原理：利用两组特殊引物对差异表达的基因进行扩增。733′端引物：利用mRNA的polyA尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，polyA尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：

5′-AGAAAAA…AA-3′5′-CGAAAAA…AA-3′5′-GGAAAAA…AA-3′5′-TGAAAAA…AA-3′5′-ATAAAAA…AA-3′5′-CTAAAAA…AA-3′

5′-GTAAAAA…AA-3′5′-TTAAAAA…AA-3′5′-ACAAAAA…AA-3′5′-CCAAAAA…AA-3′5′-GCAAAAA…AA-3′5′-TCAAAAA…AA-3′74

这些引物由11～12个T及两个其它的碱基组成，用通式5′-T11MN或5′-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。75

为10个碱基随机排列组成的随机引物。为了能对更多的基因进行分析，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5′随机引物。5′端引物765′

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3′Poly(A)RNA5′T12MN3′锚定引物逆转录5′

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3′3′MNTTTTTTTTTTTT5′变性5′

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3′3′MNTTTTTTTTTTTT5′5‘T12MN3’锚定引物寡核苷酸随机引物3′MNTTTTTTTTTTTT5′延长dNTP、Taq聚合酶3′MNTTTTTTTTTTTT5′5′M’N’AAAAAAAAAAA3′电泳显示T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C)

启动cDNA第一链合成不同长度的PCR产物回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对随机结合到cDNA链上77782.抑制性差减杂交(SSH)DiatchenkoL,etal.PNAS1996;93:6025-6030Suppressionsubtractivehybridization:amethodforgeneratingdifferentiallyregulatedortissue-specificcDNAprobesandlibraries7980方法提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经识别4碱基的限制性内切酶RsaⅠ切割实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头进行2轮差减杂交和PCR获得富集的目的基因81检测组(Tester)—

含目的基因cDNA，加接头驱逐组(Driver)—

不含目的基因cDNA，不加接头*接头含PCR引物正向SSH:易感者(Tester)+不易感者(Driver)易感者特异表达或高表达基因反向SSH:不易感者(Tester)+易感者(Driver)不易感者特异表达或高表达基因

82

抑制性差减杂交(SSH)

流程图83优点采用两次差减杂交和PCR，保证了高特异性(假阳性率可降至6％);在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异表达基因;操作相对简便，是目前别离新基因的主要方法。缺点起始材料需要g级量mRNA;SSH差减克隆片段较小，获取cDNA全长序列有一定难度。84ElkelesA,etal.MolCellBiol

，1999;19:2594-2600Thec-fosproto-oncogeneisatargetfortransactivationbythep53tumorsuppressor采用SSH法证实,在p53介导的细胞凋亡过程中，c-fos是p53转录刺激的靶基因,从而提供了这两种重要调控蛋白相互作用的直接依据。抑制性差减杂交(SSH)85KosticCandShawPH.Oncogene，2000;19:3978-3987Isolationandcharacterizationofsixteennovelp53responsegenes

通过SSH比较了p53缺失和含p53的结肠癌细胞株间基因差异表达，发现16个p53依赖的下游靶基因。抑制性差减杂交(SSH)863.基因表达系列分析

(SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE)是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法(Velculescuetal.,1995)。SAGE原理:别离每个转录本特定位置的较短单一的序列标签〔约9-11个碱基对〕，这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反响了对应基因的表达丰度。87反转录酶切连接测序单条测序＝＝对30－40条EST测序分析由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：基因表达量分析、寻找新基因等等实验步骤较长要求较高88三、基因功能的研究89

指在生物基因组中带有插入或整合的外源基因，生物个体能将它传给后代，并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。90转基因——

被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)——

目的基因的受体动物91根本方法显微注射法胚胎干细胞法(embryonicstemcells,ES细胞)逆转录病毒感染法精子载体法转基因动物中外源基因的检测染色体及基因水平：斑点杂交、Southern杂交、PCR转录水平：Northern杂交蛋白质水平：Western印迹92

获取外源目的基因含有外源目的基因的重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物转基因胚胎的发育及鉴定筛选所得的转基因动物简明操作步骤93

转基因动物实例一超级奶牛－普通奶牛的三倍大〔英国〕94转基因动物实例二东北农业大学－国内首例绿色荧光蛋白“转基因〞克隆猪绿色荧光蛋白－猪胎儿成纤维细胞－克隆95转基因动物实例三转绿色荧光蛋白的兔96转基因动物实例四正在进行转基因山羊的实验

乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊上海交通大学医学遗传研究所972.基因打靶(genetargeting)通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代9899基因打靶的必备条件胚胎干细胞(ES细胞)能在体外培养，保存发育的全能性打靶载体Neo〔新霉素〕阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)100基因敲除的根本程序101102美国犹他大学MarioR.Capecchi美国北卡罗来纳州大学Oliver

Smithies英国卡迪夫大学MartinJ.Evans2007年诺贝尔生理学或医学奖:基因打靶103104〔1〕RNA分子，催化核糖体RNA中内含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，还可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA链的复制等。〔2〕优点:其底物的碱基配对特异性。核酶与底物结合常形成“发夹〞结构或“锤头〞结构。〔3〕设计核酶特异性地结合于靶点，以其本身酶活性进行剪切。105核酶的作用机制

106

与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。

107

自身没有编码功能，但能与目标RNA特别是mRNA的特定区域互补结合的一类RNA;自然存在，或人工生物合成。1081094.RNA干扰〔RNAinterference，RNAi〕内源性或外源性双链RNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。110共抑制现象的发现

ＲＮＡｉ研究的早期线索早在20年前,来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组RichJorgensen和同事,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现:将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen将这种现象命名为共抑制(cosuppression),因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象,后来发现在其他许多植物中,甚至在真菌中也有类似的现象。

111112RNAi现象的发现线虫〔C.elegans)1995年康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues+Par-1GeneDisruptionExpressionDownDoubleStrandRNA线虫，果蝇微生物，植物

1131998年被解开———华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMello首次使用双链dsRNA高效地特异性阻断同源基因的表达。实验说明在线虫中注入双链ＲＮＡ不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为ＲＮＡ干扰。114dsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi抑制基因表达的机理siRNAassociatedWithRISCcomplexCellMembrane5’POH3’TargetmRNA115将目的基因全长序列与高活性启动子或组织特异性启动子融合，经过转化后，在诱导剂的作用下或在特定的组织细胞中，目的基因超表达，相应的基因表达产物大量积累。比较参加诱导剂前后的表型变化，从而确定目的基因在疾病发生中的作用。116Thankyou117附1、疾病相关基因的功能克隆和定位克隆1．疾病相关基因2．功能克隆3．定位克隆1181、疾病相关基因与疾病单基因病(一个基因位点上的缺陷)多基因病(涉及两个以上的基因位点)染色体病(染色体结构与数目的改变)获得性基因病(遗传易感性或病原微生物)119２、功能克隆(Functionalcloning)以获得的蛋白质表达及功能信息为线索，别离鉴定出相应的基因，叫未知基因的功能克隆。120

功能克隆〔functionalcloning〕根据特异蛋白质别离目的基因的策略表型克隆〔phenotypecloning〕根据特异mRNA别离目的基因的策略121

氨基酸序列核苷酸序列PCR特异蛋白质目的基因抗体基因文库筛选评价优点--在单基因性状的基因别离方面仍为常用策略缺点--特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难*--难以别离微量表达基因--无法研究无蛋白质产物的基因--难以进行多基因控制性状的基因别离122通过蛋白质的抗原抗体反响别离鉴定未知基因基因转录后在核糖体上翻译合成蛋白质，形成核糖体-mRNA-蛋白质产物局部氨基酸序列的复合体，运用抗体与蛋白质产物的免疫共沉淀反响，可以别离此复合体，进而别离到mRNA，最终克隆到未知基因。123124３、定位克隆疾病遗传标记，染色体定位基因序列mRNAcDNA蛋白质产物生物学功能

疾病

基因功能125定位克隆：通过遗传标记，先获得某一表型基因在染色体上的定位，再在候选区域内选择基因，进行致病突变的筛选，并获得cDNA及全基因。根本思路是通过连锁分析原理进行基因定位。假设多态标记与待定基因距离较远，那么它们在向子代传递时会发生自由别离，呈“连锁平衡〞；反之，那么不发生自由别离，而呈现“共别离〞现象，即“连锁不平衡〞。据此可在染色体上定位与某一DNA标记相连锁的基因。126将基因定位于染色体特定区段2.候选基因筛选鉴定127128家系遗传分析法选择一个含有40多个能提供信息的减数分裂事件的三代以上的家系，要排除家系的异质性；除了对照根本遗传表型的各种表现型的几率外，还要考虑外显不全；以数学计算机模型模拟分析；选择一定的遗传标记，进行基因分型，确定疾病基因在染色体上的位置。129基因连锁分析连锁分析主要是应用限制酶片段长度多态性〔RFLP〕为遗传标志进行家系分析在人类基因组中，平均约200bp可发生一对变异〔称为中心突变〕中心突变造成了序列上的多态性，不少序列多态性发生在限制酶识别位点上，产生了限制酶酶切位点的多态性用该限制酶水解DNA就会产生长度不同的片段，称RFLP。130cDNA筛选染色体定位只是定位克隆的其中一步。由于ｃDNA筛选、确认的困难，是定位克隆策略的“瓶颈〞。目前获得基因序列的方法大致有:(1)对<500kb的关键部位进行直接测序；(2)比较基因组作图和测序；(3)基因结构特征分析；(4)cDNA捕获，主要有ＣpG岛捕捉层析法、外显子捕捉法、直接筛选PCR法等方法131cDNA筛选直接法：用基因组DNA直接从cDNA文库中筛选位于该基因组片段内的cDNA。选择法：将基因组DNA固定在膜上，与总cDNA或cDNA文库的PCR产物杂交，找到能杂交到膜上的cDNA片段，再用PCR扩增这些cDNA片段。132通过EST拼接如：小鼠某基因在人当中有高度同源序列用该小鼠cDNA比对人的EST数据库得到一簇EST后，将相邻的EST通过相互重叠局部进行拼接。得到人对应的完整cDNA的序列后，两端设计引物在cDNA文库中进行PCR，得到该cDNA的克隆。至此，与小鼠对应的人的该基因得以克隆出来。133使用传统方法寻找新基因，不仅需要投入大量的资金，而且针对性不强，效率低下，大局部工作繁琐重复。通过基因芯片分析正常组织和疾病组织基因表达情况的差异，往往能够从那些表达异常的基因中发现新的致病基因。134附2、HGP与疾病相关基因的研究135随着人类基因组草图测定的完成，宣告了“后基因组时代〞的到来。功能基因组学成为研究的重心，蛋白质组学的研究受到了空前的关注，也为疾病相关基因的克隆创造了条件。136同一种细胞或组织，处于不同的状态〔生理与病理等〕，发育的不同阶段，受到外界的不同影响时，都可能使细胞中蛋白质