大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定

青岛农业大学兽医微生物学课程论文题目：大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定姓名：学院：动物科技学院班级：马业科学1201班学号：2012任课教师：温建新二0一四年四月一日材料1.1菌种大肠杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌与沙门氏菌的混合菌液1.2培养基普通培养基:肉汤、普通琼脂、半固体培养基。鉴别培养基：SS琼脂、麦康凯琼脂、三糖铁琼脂。生化鉴别基：糖发酵管、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、尿素琼脂、醋酸铅琼脂。1.3生化试剂MR试剂、VP试剂、吲哚试剂、乙醚、硝酸盐还原试剂等。1.4沙门氏菌诊断血清A~E群多价O血清及单因子血清。1.5器材革兰氏染液、显微镜、吸管等。2方法2.1增菌培养用无菌刻度吸管吸取大肠杆菌与沙门氏菌的混合菌液2ml，分别加入已有亚砷酸盐量绿增菌液100ml的试管和四磺酸钠增菌液10ml的试管个1ml.接种后轻轻混匀，置37摄氏度温箱内培养18-24h。2.2直接分离培养2.3形态观察以无菌接种环分别挑取麦康凯琼脂平板或SS琼脂平板上新鲜培养的大肠杆菌和沙门氏菌单个菌落，在在载玻片上制成涂片，待自然干燥后，以火焰固定，进行革兰氏染色，镜检。观察两种细菌的形态，大小与排列方式并做比较。这两种都是革兰氏阴性、两端钝圆的球杆菌，菌体大多单个存在，大小差异不显著。2.4培养特性观察将大肠杆菌和沙门氏菌的纯培养物分别接种肉汤、普通琼脂、三糖铁琼脂、SS琼脂和麦康凯琼脂。三糖铁琼脂接种时，先涂布斜面，后穿刺底层。置37摄氏度温箱内培养24h后，取出观察两种细菌的培养特性并比较。2.5生化试验生化实验前，须对菌种进行纯度检查，以保证不被污染杂菌。检查方法同一般培养物的制片、染色、镜检。镜检时要适当多看几个视野，每个视野中细菌形态也染色特性菌须符合该种菌种的特性。凡污染杂菌者，此菌种不可用。2.5.1糖发酵管接种每种菌纯培养物分别接种葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、卫矛醇微量生化反应管，每种唐一管，穿刺接种。后置于37℃温箱培养2-3d。2.5.2蛋白胨水接种每种菌纯培养物接种一管，培养后作吲哚实验。后置于37℃温箱培养2-3d。2.5.3葡萄糖蛋白胨水接种每种菌纯培养物接种两管，培养后一管作MR实验，另一管作VP实验。后置于37℃温箱培养2-3d。2.5.4尿素琼脂接种每种菌纯培养物接种一管，接种量要大。后置于37℃温箱培养数小时。2.5.5枸橼酸盐琼脂接种每种菌纯培养物接种一管，接种量要少。后置于37℃温箱培养2-3d。2.6生化特性的观察2.6.1糖发酵实验取经2-3d培养后的两种细菌的糖发酵管一一观察，凡培养基变为黄色的，表示该菌发酵此糖产酸气；凡凡培养基不变色的，表示该菌不发酵此糖。2.6.2MR实验取一支经2-3d培养后的葡萄糖蛋白胨水的糖发酵管，加入MR试剂数滴，凡液体呈红色者为阳性反应，呈黄色者为阴性反应，橙黄色者为可疑反应。2.6.3VP实验取另一支葡萄糖蛋白胨水的糖发酵管，加入VP试剂3ml，再加入VP试剂乙液1ml，充分摇匀后静置与试管架上，在数分钟内出现红色者为阳性反应，不出现红色者应放在37℃继续观察1-2h，仍然不变色者判为阴性。2.6.4吲哚实验去蛋白胨水培养管先加乙醚少量，塞紧棉塞摇振试管，是一米与培养基充分混匀，静置片刻，待乙醚浮于液面上层时，沿管壁加入吲哚试剂2-3滴。凡在乙醚层内出现玫瑰红色者为阳性反应，不变色者位阴性反应。2.6.5枸橼酸盐利用实验观察经2-3d培养的枸橼酸盐琼脂管是否有细菌生长，并观察其颜色变化。凡有细菌生长，培养基变为天蓝色为该菌利用枸橼酸盐，否则为阴性反应。2.6.6硫化氢实验观察经2-3d培养的醋酸铅琼脂管，凡沿穿刺线或其周围出现黑色沉淀者，为硫化氢反应阳性，无黑色者为反应阴性。2.7药物敏感试验-扩散法曲松纳、红霉素、硫酸链霉素、磷霉素、多面环素对大肠杆菌或沙门氏菌生长的影响。3结果观察3.1大肠杆菌和沙门氏菌在三糖铁琼脂培养基上的生长状况大肠杆菌反应模式表示：沙门氏菌反应模式表示：3.2细菌的染色、镜检3.3生化管的接种培养接种培养前：接种培养后：实图：3.4吲哚、MR、V-P实验实验结果;3.5药物敏感试验4结论大肠杆菌和沙门氏菌生化反应结果综合汇表菌三糖铁糖发酵甲基红VP吲哚硫化氢尿素酶枸橼酸盐利用运动力种斜面底层硫化氢葡萄糖乳糖甘露醇蔗糖卫矛醇AAA-⊕⊕/-⊕v++-+-+-+BKA+/-⊕-⊕+-+/--++/-注：⊕

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