园艺植物栽培课件组织培养技术

脱分化细胞器官成熟细胞再分化胚状体愈伤组织4愈伤组织的形成和植株再生

植物的再分化形式有两种，器官发生型和胚胎发生型，在有些情况下，再分化可以直接发生于脱分化的细胞中，无须经历愈伤组织阶段，但大多数情况下，再分化过程是在愈伤组织细胞中发生的。麻疯树插条产生愈伤组织由菊花叶片的愈伤组织分化出的小植株4.1.1愈伤组织形成的条件4.1

愈伤组织的形成离体:与植株分离，从其它组织与器官的抑制中解脱出来。合适的培养条件：大量研究表明，几乎所有高等植物的各种器官，如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、茎髓和形成层等，离体后在适当条件下，都能产生愈伤组织。

愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。当然，外植体的类型和外植物体原来在植株上所处的位置（反映了内源激素水平）对愈伤组织诱导的影响也不能忽视。

外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期诱导期分裂期形成期4.1.2愈伤组织形成的过程诱导期：细胞分裂的准备期☆诱导期是细胞准备进行分裂的时期。接种的外植体材料的细胞通常都是成熟细胞，处于静止状态，细胞大小没有多大变化，外观无明显特征，但细胞内物质代谢旺盛，王凯基等（1981）在研究离体培养的油橄榄茎段时发现，细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。☆诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊芋块茎则只要22h，但菊芋块茎经过5个月的贮藏后，诱导期则须延长到40h以上。分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期分裂期是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞的过程。外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始迅速分裂，分裂期主要表现如下：1.细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。2.每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。3.细胞体积小，内无液泡，如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。4．细胞的核和核仁增大到最大。5.随着细胞不断分裂和组织生长，细胞的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。

总之，分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态。形成期：从愈伤组织到器官发生形成期是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织（meristemoid），称做分生组织结节。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节——由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管胞、纤维细胞等，但不形成维管系统。此期细胞分裂已基本停止，细胞内发生生理代谢等的变化而开始形成一些不同形态和功能的细胞，因此有人又将此期称为分化期。以上对愈伤组织形成过程的时期的划分并不具有严格的意义，实际上，特别是分裂期和形成期往往可以出现在同一块组织上。另外，有一些研究者曾反复指出的，虽然细胞脱分化的结果在大多数情况下是形成愈伤组织，但这绝不意味着所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。相反，脱分化后可直接分化为胚性细胞而形成体细胞胚。1

愈伤组织的生长

一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。4.1.3愈伤组织增殖的方式

外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差别，如烟草、胡萝卜等脱分化较易，而禾谷类的脱分化较难；花器脱分化较易，而茎叶较难；幼嫩组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。烟草愈伤组织在8周培养期间形态的变化A是与琼脂培养基垂直方向的切面B是与琼脂培养基平行方向的切面

一个多细胞外植体通常包含着各种不同类型的细胞，因此，由它所形成的愈伤组织也是异质性的，其中不同的组分细胞具有不同的形成完整植株或器官的能力，即不同的再分化能力。2愈伤组织的继代培养

脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继代。

通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分化的增殖状态。然而，如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化，产生新的结构。4.1.4愈伤组织的状态及其调控

来源于不同植物或同一植物不同部位的愈伤组织,在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异，如颜色黄或白；外观光滑或粗糙；结构致密或松脆；遗传生理功能有胚性或无胚性。1优良愈伤组织的特性（优良的愈伤组织通常应具备以下4个特性中的2-3个特性）①旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。②高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物。③容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。④经过长期继代保存而不丧失胚性，有便有可能对它们进行各种遗传操作。2.愈伤组织的类型

主要根据对小麦、高粱和玉米等禾谷类植物体细胞愈伤组织的研究，王海波将愈伤组织分为3种主要类型：类型Ⅰ：保守分裂型，结构致密，生长较慢，容易分化成苗类型Ⅱ：亢进分裂型，结构松脆，生长旺盛，色泽鲜艳，增殖很快类型Ⅲ：衰败型，结构疏松，生长缓慢，色泽暗淡注意：1.在这3种类型之间还存在许多过渡类型。

2.类型Ⅰ和类型Ⅱ之间在一定程度上可以相互转变，衰变型细胞在一定程度上也可以得到控制。

能够促进这种转变和控制的因子有几种，其中最主要的是植物激素和氮源形态。

氮源除了供给培养物氮素营养外，氨态氮还具有促进细胞分裂的作用，硝态氮具有抑制细胞分裂的作用。当增加生长素浓度促进细胞分裂的效果不明显时，增加培养基中的氨态氮可起到明显的促进分裂的作用；当使用细胞分裂素或降低生长素对细胞分裂的抑制效果不显著时，增加培养基中的硝态氮或减少氨态氮，可起到显著的抑制分裂的作用。致密愈伤组织（A）与疏松愈伤组织（B）细胞结构的比较1.巨大细胞；2.管状细胞；3.细胞间隙3愈伤组织状态的调控（1）选择适当的基因型和适当的外植体

虽然几乎所有高等植物的器官和组织都有可能产生愈伤组织，但同一物种内不同基因型在离体培养中的反应可能不同，同一植株不同部位的细胞在离体培养中的反应也可能不同。基因型材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性的影响。不同植物种的器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜和矮牵年等植物容易诱导器官形成，而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。器官和部位

通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其差别均不大。但是对有些植物而言，确有明显差异。如油菜的花器官比叶、根易于分化成苗，水稻和小麦幼穗的苗分化频率也比其他器官为高。年龄年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。如油菜植株的自下而上的茎段的培养结果表明，下部的器官形成频率低，愈向上部，苗的分化频率越高。因此在组织培养中，要及时转移已形成的愈伤组织进行分化培养，可大大提高苗的分化频率。2.选择正确的培养基

培养基的各种成分和物理性质，都对器官发生产生一定影响，但起决定作用的仍然是植物生长调节剂，特别是生长素和细胞分裂素的配比。3.采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件。

加入一些常规培养基中不用的物质和条件。4.2器官分化

愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形态建成，可再产生完整的植株。形态建成：外植体在适宜的培养条件下经脱分化、再分化或直接发育成各种形态完整的植物体的过程。

在愈伤组织培养物中，细胞分裂常以无规则方式发生，并产生无明显形态或极性的无序结构组织块，这时虽然在愈伤组织中发生了细胞分化，形成维管化组织和瘤状结构，但并无器官发生。只有满足某些条件，才可从愈伤组织发生再分化而产生苗或根的分生组织，甚至胚状体，进而使它发育成苗或完整植株。4.2.1器官发生概念：离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的过程。发生方式：有两种发生方式（1）直接发生：外植体直接分化成器官的过程。（由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等器官发生）（2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。

在组织培养中，从外植体形成器官或无性系的形态发生，有下面两种途径：1．器官发生途径通过茎芽的分化形成不定芽实现，指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。器官发生途径产生再生植株的基本方式有3种：（1）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出根而形成小植株，多数植物属这种情况；（2）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；（3）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。颠茄悬浮培养细胞先分化根后形成芽的过程2．胚状体方式（somaticembryo）

指由培养细胞诱导分化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。（后一节中介绍）4.2.2影响茎芽分化的因素1化学因素主要是激素的种类和浓度。

生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。

高有利于根的形成和愈伤组织的形成

生长素/细胞分裂素适中有利于根芽的分化低有利于芽的形成

生长调节物质的使用甚微，一般用mg／L表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05-5mg／L，细胞分裂素0.05—10mg／L。GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfacetissuecultureintheAfricanVioletNosucrose(0%)Veryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.tissuecultureintheAfricanViolettissuecultureintheAfricanVioletSucrosereducedto1%Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredtissuecultureintheAfricanVioletSucroseincreasedto5%Shootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanVioletNoBAP

Profusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.UndifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplanttissuecultureintheAfricanVioletBAPreducedto0.1mg.l-1

Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplanttissuecultureintheAfricanVioletNoNAAPoorshootdevelopmentandnorootstissuecultureintheAfricanVioletNAAreducedto0.1mg.l-1

Poorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationtissuecultureintheAfricanVioletProfusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNAAincreasedto5.0mg.l-1tissuecultureintheAfricanVioletNosignofregenerationfromexplantatall.

NoMSsaltstissuecultureintheAfricanVioletSomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsreducedto0.47g.l-1

tissuecultureintheAfricanVioletShootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.MSsaltsincreasedto9.52g.l-1

2物理因素培养基形式：在固体培养基上，粉蓝烟草×郎氏烟草的组织培养物以一种完全无结构的状态生长，但在成分相同的液体培养基中，则能形成茂密的茎芽。渗透压：在一个双单倍体马铃薯品种叶肉原生质体获得的愈伤组织中，只有在培养基里加入0.2-0.3mol/L甘露醇以使渗透压保持在200-400毫渗透压摩尔时，才可能出现茎芽的分化。否则，愈伤组织不能变绿，而愈伤组织变绿是芽分化的前提。光强和光质：高强度的光照对烟草茎芽的形成有抑制作用，天竺葵愈伤组织只有在光照和黑暗交替条件下才能分化茎芽，培养在连续光照下无器官分化。温度：Skoog在5-33℃的范围内研究了温度对烟草愈伤组织分化和生长的影响，发现直到33℃时愈伤组织的生长都随温度的上升而增加，但只有在18℃时最适合茎芽的分化，在33℃时不能形成茎芽。3其它因素培养材料的染色体组供提植株和外植体的生理状态外植体的细胞发育状态培养物的历史和内生激素水平。4.3体细胞胚胎发生4.3.1体细胞胚胎发生的方式有两种发生方式（1）直接发生：从培养的器官、组织、细胞或原生质体直接分化成胚，中间不经过愈伤组织阶段。（2）间接发生：外植体先愈伤化，然后由愈伤组织再分化成胚。A.由外植体外层细胞直接产生体细胞胚B.由外植体组织内的细胞产生体细胞胚C.愈伤组织表层细胞分化为体细胞胚4.3.2影响体细胞胚胎发生的因素

1．生长调节物质（1）生长素类：

我们以离体培养条件下胡萝卜的体细胞胚胎发生的诱导过程来进行分析：

在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。

愈伤组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养基（增殖培养基），通常所用的生长素是2，4-D，浓度范围0.5～1mg/L。在这样一种培养上，愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团，称作“胚性细胞团”（CE)。在增殖培养基上反复继代，胚性细胞团的数量不断增加，但并不出现成熟的胚。然而，如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养（成胚培养基）上，它们就能发育为成熟的胚。看来，在增殖培养基中生长素的存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少的。连续保存在无生长素培养基中的愈伤组织不能形成胚。在这个意义上，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的“诱导培养基”，而把每个胚性细胞团看成是一个无结构的胚。野生胡萝卜悬浮培养中体细胞胚胎发生过程的模式图（2）细胞分裂素类：

细胞分裂素对于体细胞胚胎发生的作用有相反的结论，既可促进也可抑制体细胞胚的发生，这主要取决于植物的种类及其基因型。

一般而言，细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显著作用，特别有利于子叶的发育。

另外有研究表明，不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的专一性，如在胡萝卜的研究中发现，虽然BAP和激动素对胚胎发生过程表现抑制作用，但浓度为0.1μmol/L的玉米素却能促进这个过程，而BA对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖，但不形成胚性愈伤组织。（3）赤霉素类：赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生，但对于许多植物而言，赤霉素对于体细胞胚胎的成熟与萌发有促进作用。（4）脱落酸：抑制剂特别是ABA，在体细胞胚胎发生过程中的作用正逐渐被提示出来，ABA是一种天然产生的生长调节剂，当把无抑制作用剂量（通常是0.1~1μM）的ABA用于荷兰芹属培养物时，可以允许胚成熟过程进行。但是其抑制异常增殖，包括不定胚的启动。另一方面抑制早熟萌发。2氮源

氮源的形态有还原态氮（NH4+）和氧化态氮（NO3－）两种。

在以KNO3为唯一氮源（如White培养基）的培养上建立起来的愈伤组织，去掉生长素以后不能形成胚。然而是，若在培养基中加入少量NH4Cl即可明显促进胚状体的发育，上述结论是否说明，胚胎发生过程中还原态氮是必需的？我们可以对以下的实验进行分析。Reinert及其合作者在栽培胡萝卜愈伤组织培养中(培养基均为White培养基)得到以下结果：

[NH4+—氮]（M）[NO3——氮]（M）体胚发生数（个/2ml）

10401131±2190550.9±0.309511.3±4.1

从上表可以分析得出，尽管高浓度的氧化态氮同样可以诱导体细胞胚胎发生，但是其诱导率远远低于还原态氮和氧化态氮配合使用时的诱导率。

与KNO3不同，当以NH4Cl为唯一氮源时，只要经常调节pH值使其保持在5.4，胚胎发生率可与在NH4Cl和KNO3

最适配比的情况下相当。当只有NH4Cl时，培养基的pH值在4d之内将有5.4降到4～3.5，这对胚胎发生是有抑制作用的。由此看来，还是搭配使用NH4＋和NO3－较为方便。3其它因子钾离子的浓度:高浓度的钾(20mmol／L)是胚胎发生所必须的。培养基中溶解氧的含量：应低于一个临界值（1.5mg／L），否则有利于生根，而不利于成胚。低溶解氧、高ATP活性炭:由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：4.3.3体细胞胚胎的成熟过程1)外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组织。这一阶段同不定芽方式一样。2)胚状体形成细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。3)胚状体再发育成完整植株在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。在活体和离体条件下胚和茎芽的下端在解剖学上的差别A、D、F是胚B、C、E是茎芽胚状体与不定芽的区别胚状体在组织学上具备以下和不定芽不同的三个特征：①最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。③胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象。胚状体也是植物组织培养形态发生最常见而重要的方式，它较不定芽方式有更多的优点：如胚状体产生数量比不定芽多；胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。这些对组织培养应用于育种是十分有利而重要的。合子胚胚状体质量萌发率高，质量好萌发率低，质量差来源受精卵体细胞胚柄有，明显即使有也不明显形态固定，体积相对较小复杂，常有两个以上的子叶体积相对较大变异率低高胚状体与合子胚的比较体细胞胚常常能在原来的培养基上成熟和萌发。注意：在不经冷处理种子就不能萌发的物种中，幼龄或成熟的胚可能必须先经历一段低温之后才能正常的长成小植株。葡萄体细胞胚：低温处理时期球形期～成熟期均可低温处理温度4℃2周花菱草体细胞胚低温处理后才能萌发。柑橘属植物草体细胞胚萌发期间，需要使用GA3以促进根和茎的发育。4.3.4长期培养物形态发生潜力的丧失

有些愈伤组织或悬浮培养物起初具有器官发生或胚胎发生的潜力，但经过反复继代保存之后，这种形态发生能力常常逐渐下降，有些甚至完全损失。为了解释这种现象，现在有三种假说。1遗传说该假说认为，形态发生潜力的丧失是由于在培养细胞中的核的特性发生了改变，即细胞核内的遗传物质在培养继代过程中由于变异等原因而发生了改变或是突变。因此，由这种原因所造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。2生理说随着不断的培养继代的进行，培养组织或细胞中的内源激素平衡关系可能会发生改变或是由于对外源生长物质的敏感性发生改变，从而导致不能形态发生。在这种情况下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化，但并不一定就丧失了这种分化能力。因而，在这种情况下，如果改变外部处理条件，应该有可能使细胞的这种内在潜力得到恢复。

如Fridborg和Eriksson(1975)发现，在含有2，4-D的培养基上培养8周之后，本来具有全能性的胡罗卜培养物完全停止了胚胎发生的过程，然而，向这种培养基中加入1％～4％的活性炭之后，丧失了的全能性又可以得以恢复。在这个培养系统中，胚性潜力的丧失可能是由于内源生长素水平提高所致。3竞争说这个假说本质上是前两个假说的结合。按照这个假说的倡议者Smith和Street（1974）的看法，在胡萝卜细胞长期连续继代培养基间，有两个过程可能与胚胎发生能力的下降以至最终的丧失有关。首先，细胞对于生长素（2，4-D）抑制全能性表达的作用变得比较敏感；其次，随着时间的推移，由于培养细胞在细胞学上的不稳定性，出现了缺乏胚性潜力的新的细胞系，这些细胞学上的变化不一定是染色体数目的变化，而可能只是遗传信息的小的突变、丢失或易位，实际上，Jones（1974）已经证实，在胡萝卜培养物中，细胞群体在成胚能力上的不稳定性，可能是由用于建立该培养物的组织带来的。

在复杂的多细胞外植体中，只有少数细胞能够产生胚性细胞团，其余细胞都是无法表达其全能性的。即存在胚性的细胞类型和非胚性的细胞类型按照这种假说，如果非胚性的细胞类型在所用的培养基中具有生长上的选择优势，在反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会爱步增加，而胚性成分则逐渐减少。到了一定时期之后，在培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。然而，如果在培养物中存在少量胚性细胞，只是由于处在支配地位的非胚性细胞的抑制作用，这些胚性细胞的全能性无法表达，在这种情况下，通过改变培养基成分，使之有选择地促进全能细胞的增殖，就应当有可能恢复该培养物的形态发生潜力。4.5人工种子

人工种子（artificial

seed）是指通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外面还被有特定物质，在适宜条件下可以发芽成苗的植物幼体。

最早提出人工种子概念的是著名植物组织培养学家Murashige。他于1978年在加拿大召开的第四届国际植物组织细胞培养会议上，首次提出利用植物组织培养中具有体细胞胚胎发生的特点，把胚状体等组织包埋在胶囊内形成球状结构，使其具有种子的机能并可直接播种于田间的设想。

按照他的设想，“人工种子’，最外面为一层有机的薄膜包裹，起防止水分散失及保护作用。其中含有培养物所需的营养成分和某些植物激素，以作为植物材料萌发时的刺激因素并提供能量，最里面就是被包埋的胚状体或芽体等植物材料。通过这几部分的组合，人为地创造出一种与天然种子相类似的人工合成种子（syntheticseed)，因此又叫人造种子（manmadeseed.）或无性种子（somaticseed)。

人工种子制作程序：1.高质量体细胞胚胎发生系统的建立2.体细胞胚胎发生的同步化控制3.人造种皮及人造胚乳研制与包埋4.人工种子的转换（体细胞胚胎发育成据正常表现型的绿色植株的能力）5.1快速繁殖的操作程序阶段Ⅰ:无菌培养物的建立;阶段Ⅱ:茎芽的增殖;阶段Ⅲ:离体形成的枝条的生根;阶段Ⅳ:植株的移栽.5园艺植物快速繁殖技术和无病毒良种的繁育5.1.1无菌培养物的建立⑴外植体:最适用的是带芽的茎段；茎尖;花序（花椰菜）其它组织、器官由植物种类和茎芽增殖方法而定①有些植物的特殊园艺性状是由病毒造成的。如天竺葵品种“鳄鱼”的透明叶脉，脱毒后消失。如天竺葵品种”鳄鱼”的茎尖培养（上）和叶柄培养（下）注意：②通过形成不定芽进行快繁时，可用根段、茎段或珠心做外植体，由天然形成不定芽的能力决定③一般不通过愈伤组织进行快繁。⑵消毒：无菌外植体；温室栽培；套袋；水培5.1.2

茎芽增殖的4种途径

茎芽的离体增殖，除了兰花所特有的原球茎途径之外，有以下4个途径：通过愈伤组织通过不定芽形成单芽茎段扦插增强腋芽生枝注意愈伤组织培养的缺点：（1）通过愈伤组织是进行植物繁殖最快的方法。①细胞在遗传上的不稳定性；②随着继代保存时间的增加，愈伤组织最初表现的植株再生能力可能逐渐下降，最后甚至完全消失。原理：无限增殖的可能性；细胞的全能型

Ⅰ愈伤组织及不定芽的诱导

小红枫的组织培养

Ⅱ

愈伤组织诱导不定芽的再生Ⅲ

生根Ⅳ

炼苗移栽（2）不定芽形成：根、鳞茎和叶都能形成不定芽。有350个物种，他们的叶都能形成不定芽。

在培养条件下，植物产生不定芽的频率可以显著提高。

如在秋海棠中，一般情况下芽只是沿着切口形成，但在含有BAP的培养基中，可在整个外植体的表面形成。

据Takayama等报道有一种秋海棠幼叶的7mm×7mm的切段在1年中产生了1014个植株。花斑天竺葵品种MmeSalleron茎尖培养（上）和叶柄节段培养（下）不定芽培养会招致嵌合体裂解。（3）增强腋芽生枝能力原理：雏梢（4）单芽茎段扦插11.2.3影响茎芽增殖的因素⑴培养基无机盐激素⑵光照和温度：光强：光的作用只是满足某些形态发育过程的需要，因此1000~5000lx的光强即已足够。光周期严格的说也不重要。每天16h光照/8h黑暗交替照明，即可产生令人满意的效果。光照:温度：25℃（1）试管内生根：当小枝条长1cm左右时，转插到生根培养基中。

若茎芽增殖是在全强度MS培养基上进行的，生根培养基中盐的浓度应减少到1/2或1/4。5.1.4离体形成的枝条的生根

对于大多数物种来说，诱导生根需要有适当的生长素，其中最常用的是NAA和IBA，浓度一般为0.1~10.0mg/L，但唐菖蒲、水仙和草莓等例外，它们的枝条很容易在无激素培养基上生根

也可将枝条下端浸在高浓度生长素溶液中若干时间（由几秒到几个小时）后，再插于无激素培养基中生根所需时间由10d到15d不等。根长5mm时移栽最为方便。（2）试管外生根：

先用激素处理，再插于基质中，或先诱导出根原基，再扦插。

试管内嫁接:有叫微体嫁接，即以试管苗的0.1~0.2mm长的茎尖为接穗，以在试管内预先培养出来的带根无菌苗为砧木，在无菌条件下借助显微镜进行嫁接，之后继续在试管内培养，愈合后成为完整植株再移入土中。5.1.5无根苗的嫁接试管外嫁接：砧木可大可小。微嫁接技术在一些园艺植物上都有成功的报道,如柑桔、樱桃、阿月浑果子树、核果、苹果、葡萄等果树。5.1.6壮苗、炼苗和移栽

试管苗生长在恒温、高湿、弱光、无菌和有完全营养供应的特殊条件下，虽有叶绿素，但营异养生活，因此在形态解剖和生理特性上都有很大脆弱性，例如水分输导系统存在障碍，叶面无角质层和蜡质层，气孔开张过大且不具备关闭功能等。

壮苗：

是移栽成活的首要条件，但培育壮苗的方法则因材料和情况的不同而异。如在培养基中加入一定数量的生长延缓剂如pp333、B9、CCC等，在许多植物上都可获得壮苗。

炼苗：

开瓶炼苗降低瓶中湿度，增强光合强度，以便促使叶表面逐渐形成角质，促使气孔逐渐建立开闭机制，促使叶片逐渐启动光合功能等。炼苗的具体措施：

则因苗的种类不同而异。

有些单子叶草本植物，只要壮苗，炼苗方法十分简单：拿掉封口塑料膜，在培养基表面加上薄薄一层自来水，置于散射光下3~5d即可。

有些植物如霞草和刺槐试管苗极易萎蔫，封口膜在炼苗开始时只能半开，且要求炼苗环境有较高的空气湿度。

喜光植物如枣和刺槐可在全光下炼苗，耐荫植物如玉簪和白鹤芋等则须在较荫蔽的地方炼苗，萱草、月季、福禄考、油茶等可在50%~70%的遮荫网下炼苗。移栽：

移栽时先要轻轻地但彻底地洗掉沾在根上的琼脂培养基，以免栽后发霉。

要选用排水性和透气性良好的移栽介质，如蛭石、河沙、珍珠岩、草炭和腐质土等，栽苗之前须用0.3%~0.5%的高锰酸钾消毒。

移栽后，最初10~15d要通过喷雾或罩上透明塑料以保持很高的湿度（90%~100%），在塑料罩上可打些小孔，以利气体交换。在保湿数天之后，可把植株搬入温室，但仍须遮荫数日。移栽时把小植株上的一部分叶片剪掉也可能是有益的。移栽苗成活的必要条件是：

空气湿度高，土壤通气好，太阳勿直照。

移栽后完成上述各个步骤可能需花费4~6周的时间，此后即可让这些植物在正常温室或田间条件下生长。

热处理是应用最早的脱毒技术，具有操作简单、见效快的特点。5.2培养脱毒苗的原理和方法5.2.1

通过热处理消除病毒柑橘脱毒容器育苗

热处理的理论依据是在高温下病毒钝化，复制明显减弱或不再繁殖，而植物在高温下生长较快，将植物在高温下培养数周至数月，这个期间生长的嫩梢不带病毒。

热处理的关键问题是存活率和脱毒率，温度和持续时间、热处理方式等对存活率和脱毒率有影响。热处理的方法：热水处理：对休眠芽效果较好。热空气处理：对活跃生长的茎尖效果较好。

把旺盛生长的植株移入到一个热疗室中，在35~40℃下处理一定时间即可；处理时间的长短可由几分钟到数周不等。Baker和Kinnaman（1973）把麝香石竹植株在38℃下连续处理2个月，从而消除了茎尖内的所有病毒。

马铃薯病毒X则要求在35℃下处理几个月才能得到一些无病毒茎尖。

热处理时，最初几天空气温度应逐步增高，直到达到要求的温度为止。若钝化病毒所要求的连续高温处理会伤害寄主组织，则应当试验高低温交替的效果。热处理后要立即把茎尖切下来嫁接到无病的砧木上。在热处理期间应当保持适当的湿度和光照。

根据Baker和Kinnaman（1973）的建议，在对麝香石竹进行脱毒热处理时，相对湿度必须保持在85%~95%之间，准备接受热处理的植株必须具有丰富的碳水化合物储备。并非所有的病毒都对热处理敏感，如在马铃薯中，此法只能消除卷叶病毒。一般来说对于等径的和线状的病毒和已知的类菌原体引起的病害，热处理有效。在用热疗法消除病毒时应注意：延长寄主植株的热处理时间，也可能会钝化植物组织中的抗性因子，因而和对照相比会降低处理效果。热处理之后只有一小部分植株能够存活。

李属植物病毒一般在38℃左右可被钝化，通常采用38℃作为处理温度。但李属植物耐热性差，38℃恒温处理死亡率高。

采取一些改进措施可有效提高存活率，同时不影响脱毒率。这些措施包括昼夜变温(38℃，16h，光照；25～30℃，8h，黑暗)；预先处理；降低土温(29℃)，处理期间浇水；高CO2，降低根部温度。

一般认为高温(38℃)长时间处理，脱毒率高，但有的病毒是让寄主植物在低温下生长一段时间来消除的，对于这些病毒侵染的植物变温处理存活率和脱毒率均高于恒温处理。

低温处理结合微嫁接或茎尖培养，高浓度细胞分裂素、多次继代结合低温处理也是有效的脱毒途径。5.2.2通过茎尖培养消除病毒White(1934)和Limasset等(1949)研究表明，病毒浓度呈梯度变化，病毒粒子随植物组织的成熟而增加，旺盛生长的根尖、茎尖很少有病毒分布。Morel等(1952)首次通过茎尖培养成功获得脱毒的大丽花，以后茎尖培养相继用于桃、樱桃、樱花、豆樱、山樱花等植物脱毒。

茎尖的成活率和脱毒率是茎尖脱毒培养的两个关键环节。褐化是降低茎尖培养成活率的首要原因。

茎尖大小、取材季节、培养方式、激素浓度、基本培养基、培养基添加物都对茎尖褐化有影响。茎尖越小，褐化越严重。

同等大小茎尖休眠季节取材、液体培养、添加低浓度激素成活率高于休眠前期或生长期取材、固体培养、添加高浓度激素。茎尖和顶端分生组织的区别顶端分生组织（apicalmeristem，apicaldome）是指茎的最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径约100µm，最大长度约为250µm。茎尖（shoottip，meristemtip，shootapex）是由顶端分生组织及其下方的1~3个幼叶原基一起构成的。

虽然通过顶端分生组织培养获得消除病毒的机会较高，但大多数无病毒植株都是通过培养100~1000µm长的外植体得到的，即通过茎尖培养得到的。获得表面不带病原菌外植体的方法培养无病植株：无菌土、内吸杀菌剂、水培；表面消毒：叶片包被严紧的芽如菊花、菠萝、姜、兰花等只需在75%的酒精中浸蘸一下；叶片包被松散的芽如蒜、麝香石竹、马铃薯等则要用0.1%次氯酸钠溶液表面消毒10min。对于这些消毒方法，在工作中应灵活运用，以便适应具体的实验体系。防茎尖失水解剖镜细镊子解剖针长柄刀片闪亮半圆球的顶端分生组织或茎尖5.2.3热处理+茎尖培养

顶端分生组织有时也带有病毒，如麝香石竹茎尖100长的顶端部分，有33%带有麝香石竹班驳病毒，菊花中，有300~600长茎尖的愈伤组织形成的全部植株都带有病毒。

若把茎尖培养与热疗法结合起来，也有可能获得脱毒植株。热处理可在切取茎尖之前在母株上进行，也可在茎尖培养期间进行。用前一种方法可以切取较大的外植体进行培养。

若连续高温处理会引起受处理植株的组织损伤，可以试用昼夜或隔日高低温交替处理。如为消除马铃薯芽眼中的马铃薯卷叶病毒，使用40℃（4h）＋6~20℃（20h）两种温度的交替处理。40℃连续高温处理会杀死芽眼。5.2.4化学处理

目前国际上常用的是两种植物生长调节物质:2,4-二氧六氢三氮杂苯(DHT)和类似嘌呤碱基代谢物质病毒唑。

作用机理为这两种物质可抑制病毒复制。Deogrativos等报道培养基中添加病毒唑，甜樱桃可脱除ACLSV、PNRSV、PDV。对苹果田间植株直接喷施该类物质也可获得脱毒苗。⑴物种的局限性⑵无性系变异：变异的累积；愈伤组织；克服办法：限制一个外植体的繁殖株数；限制离体繁殖周期的数目。5.3园艺植物组织培养中存在的问题和对策5.3.1

微繁中存在的一些问题⑶培养物污染：⑷玻璃化：

某些慢速生长的病原菌（特别是内生菌）可能依然存在。污染物的长期存在会引起试管苗生活力下降，叶片缺绿，甚至死亡。抗生素或杀菌剂有可能控制这些污染物进一步扩展，但不可能杀灭这些污染物。最好的办法是无毒外植体。

与正常组培苗相比，玻璃化苗在形态学上发生了显著变化，其共同特点是呈半透明状，并且可分为外观形态明显异常和基本无异常2种类型。此外，玻璃苗的茎尖顶端分生组织相对较小；茎尖发育部分保持分生能力的时期也缩短；叶片表面缩小或增大，叶片皱缩并纵向卷曲，脆弱易破碎，颜色不正常；幼苗难以生根等。

5.3.2玻璃化现象

褐化是指在离体繁殖过程中，由培养材料向培养基中释放褐色物质，使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之变褐死亡的现象。加以控制。5.3.3培养基的褐变5.3.4变异

离体快繁可获得大量形态、生理特性不变的植株，也可能出现些变异，特别是通过愈伤组织形成的或悬浮培养繁殖的幼苗，更具有普遍性。5.3.5污染

在离体繁殖过程中，细菌和真菌侵染培养基产生菌斑使培养材料不能正常生长和发育，以至死亡的现象称为污染。细菌污染的特点是菌斑呈黏液状，在接种1～3d后即可发现。真菌污染的特点是污染部分会有不同颜色的霉菌，接种后3～10d才发现。牡丹的器官培养与快速繁殖外植体部位目前已报道的牡丹器官培养中，多数以鳞芽为外植体进行研究，包括腋芽、土芽、花芽、顶芽,也有以其他部位如叶柄、叶片、上胚轴和萌生条等。在所有鳞芽中，以土芽的分化表现最好，分化率可达94%，花芽最差仅16%。

不同取材时期对芽培养也有影响：12月至次年2月取材，经过低温休眠，芽充分分化，营养物质累积丰富，苞片紧密，污染率低，成活率高，萌发时间早，因此，此时期取材最好。嫩叶愈伤组织的诱导率、不定芽的分化率均高于叶柄。萌生条的表现最差，不仅污染和褐变死亡现象严重，而且成活率很低，仅11.7%，难以分化。表面灭