第十二章 微生物工程生产举例

第十二章微生物工程

生产举例提纲第一节抗生素生产工艺第二节氨基酸生产工艺第三节柠檬酸生产工艺第四节污水的生物处理第一节抗生素生产工艺重点：抗生素的生物合成；微生物的次级代谢与初级代谢的关系；抗生素生物合成的代谢调节机制；细胞生长期到抗生素产生期的过渡；酶的诱导作用；分解代谢产物的调节控制；难点：抗生素生物合成的代谢调节机制；分解代谢产物的调节控制。概述一、抗生素的分类按生物来源、作用、化学结构、作用机制、合成途径可分为：表22-1二、抗生素生产工艺二、抗生素生产工艺二、抗生素生产工艺二、抗生素生产工艺二、抗生素生产工艺2、化学合成法根据某种抗生素的化学组成和结构，通过化学合成的方法，可生产局部抗生素。如：氯霉素、磷霉素等。经过化学合成方法和控制条件的不断深入研究，越来越多的抗生素可用化学合成法生产。二、抗生素生产工艺三、青霉素生产工艺三、青霉素生产工艺三、青霉素生产工艺1、菌种：产黄青霉生长发育分六个阶段：Ⅰ—Ⅳ期：菌丝生长期，适宜做种子；Ⅳ—Ⅴ期：青霉素分泌期；Ⅵ期：菌丝体自溶期。三、青霉素生产工艺三、青霉素生产工艺3、发酵条件控制补糖：残糖降至0.6％〔PH上升〕；补氮：氨氮0.05％，补硫铵、氨水或尿素；PH：6.4—6.6，加糖、加酸、加碱调节；温度：前期，25-26℃；后期，23℃；通气比：1：0.8；溶氧：﹥氧饱和溶解度的30％；消沫剂：玉米油、豆油或化学合成消沫剂。三、青霉素生产工艺4、青霉素的别离纯化过滤：板框、真空转鼓；萃取：醋酸丁脂，2-3次；脱色：活性碳，150-200g/10亿单位；结晶：浓缩结晶或直接结晶；洗涤枯燥第二节氨基酸生产工艺一、氨基酸生产工艺控制二、氨基酸生产工艺三、异亮氨酸、亮氨酸生产工艺概述工业上重要氨基酸简介一、氨基酸生产工艺控制1、菌种：细菌，野生型或营养缺陷型、结构类似物突变菌种；2、培养基：碳源：淀粉水解糖、糖蜜等；氮源：铵盐、氨水或尿素，豆饼、麸皮粉；无机盐：S、P、Ga、Mg、K等；生物素：影响细胞膜透性，对氨基酸分泌影响很大，来源：玉米浆、麸皮、糖蜜。一、氨基酸生产工艺控制3、发酵条件控制PH：通过流加氨水或尿素来控制；温度：菌体生长和产物形成最适温度不同，并随菌种不同而异；溶氧：不同氨基酸发酵有不同要求；消沫剂：玉米油、豆油或化学合成消沫剂。一、氨基酸生产工艺控制4、氨基酸别离纯化过滤：板框；提取：等电点沉淀；脱色：活性碳，〔过滤除活性碳〕；精制：离子交换或重结晶法。二、氨基酸〔赖氨酸〕生产工艺重点：

赖氨酸生物合成途径及代谢调节机制；酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径和调节机制；赖氨酸生产菌的育种途径。难点：天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调节机制。二、氨基酸生产工艺氨基酸的生物合成1、天冬氨酸族生物合成途径

天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨酸为原料，合成苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。天冬酰氨甲硫氨酸

琥珀酰高丝氨酸合成酶草酰乙酸→天冬氨酸→天冬氨酸磷酸→天冬氨酸-β-半醛→高丝氨酸→苏氨酸→异亮氨酸

DDP合成酶

二氨基庚二酸→赖氨酸2、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制在细菌中，虽然天冬氨酸族氨基酸生物合成途径是相同的，但是其代谢调节机制是多种多样的。1〕大肠杆菌K12①天冬氨酸激酶②天冬氨酸-β-半醛脱氢酶③DDP合成酶〔赖氨酸分支的第一个酶〕④高丝氨酸合成酶〔HD〕〔通向苏氨酸、蛋氨酸分支的第一个酶〕2、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制2〕黄色短杆菌其赖氨酸生物合成调节机制比大肠杆菌简单，其天冬氨酸激酶只有一种，该酶具有两个变构部位，可以与终产物结合，当两种终产物同时过量时，该酶活性受到抑制。3〕乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调节3、酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径就赖氨酸合成途径来讲，不同种类的微生物途径不同，可以归纳为两条途径：1〕为经过二氨基庚二酸的生物合成途径，如细菌、DPA；2〕是AAA，酵母菌、霉菌经过α-氨基己二酸AAA途径合成赖氨酸。4、氨基酸生物合成的调节机制反响抑制与优先合成氨基酸生物合成的根本调节机制有反响抑制与在合成途径分支点处的优先合成。反响抑制：A→B→C→D

ED优先合成：A→B→CFG5、其他特殊的控制机制1〕终产物控制催化分支合成途径共同局部的初始酶，在仅一种氨基酸终产物过剩时，完全不受或微弱或局部地反响抑制〔或阻遏〕，只是在多数终产物共存下才强烈地控制。有以下几种情况：①协同〔或多价〕反响抑制②合作〔或增效〕反响抑制③同功酶控制④积累反响抑制5、其他特殊的控制机制2〕顺序控制：EDA→B→CFGA→B→C→D6、赖氨酸生产菌的育种途径出发菌株的选择：要求代谢比较简单的细菌〔如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌等〕1〕优先合成的转换：渗漏缺陷型的选育。2〕切断支路代谢：营养缺陷型的选育。3〕抗结构类似物突变株的选育〔代谢调节突变〕。4〕代谢互锁解除代谢互锁的方法：①选育亮氨酸缺陷型菌株，或者以抗AEC的赖氨酸的生产菌为出发菌株，经诱变得到抗AEC兼抗亮氨酸缺陷型菌株。②选育抗亮氨酸结构类似物的突变株，从遗传上解除亮氨酸对DDP合成酶的阻遏。③选育对苯醌或喹啉衍生物敏感菌株，这是一种寻找亮氨酸渗漏缺陷型菌株的有效方法。6、赖氨酸生产菌的育种途径5〕增加前体物的生物合成和阻塞产物的生成：方法：①选育丙氨酸缺陷型；②选育抗天冬氨酸结构类似物突变株；③选育适宜的活性比突变株；6〕改变细胞膜的透过性7〕选育温度敏感突变株8〕应用细胞工程和遗传工程育种9〕防止高产菌株回复突变7、赖氨酸生物合成途径大肠杆菌的赖氨酸生物合成途径：图23-28、赖氨酸发酵条件控制溶氧：特别重要，缺乏，会使赖氨酸生产受到不可逆抑制；PH：通过补加氨水来控制；温度：32℃；前体：甘氨酸或丝氨酸。〔短小假单胞菌〕三、异亮氨酸、亮氨酸生产工艺1、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物合成途径：图23-4

2、异亮氨酸发酵两种方法：添加前体发酵法和直接发酵法添加前体发酵法：苏氨酸脱水酶受异亮氨酸的反响抑制；添加前体物质D-苏氨酸、α-酮基异戊酸；绕过异亮氨酸对苏氨酸脱水酶的反响抑制。直接发酵法：抗反响调节突变株，解除对苏氨酸脱水酶的反响抑制。3、亮氨酸发酵亮氨酸高产菌株的选育：1〕选育α-酮基异丁酸抗性突变株，解除对异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸生物合成酶系的阻遏作用；2〕选育异亮氨酸缺陷型回复突变株，其α-异丙基苹果酸合成酶不再受亮氨酸的反响抑制；3〕α-噻唑抗性兼蛋氨酸、异亮氨酸双重缺陷型突变株，用于亮氨酸的发酵生产。第三节柠檬酸生产工艺重点：柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物合成的代谢调节；三羧酸循环的调节。难点：柠檬酸生物合成的代谢调节；糖酵解及丙酮酸代谢的调节。一、柠檬酸发酵生产工艺〔一〕柠檬酸合成途径柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。

柠檬酸合成途径：丙乙酰COA葡萄糖酮→柠檬酸酸草酰乙酸氧化脱羧羧化EMP〔二〕柠檬酸生物合成的代谢调节1、糖酵解及丙酮酸代谢的调节1〕在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而ATP、无机磷、铵离子对该酶那么有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。2〕比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成〔合成〕代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。3〕丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。〔二〕柠檬酸生物合成的代谢调节2、柠檬酸生物合成代谢调节的特点：1〕TCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点。2〕第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低〔TCA环被阻断〕。3〕氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。〔二〕柠檬酸生物合成的代谢调节3、柠檬酸积累的原因：①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4↑有一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链；②由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反响的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。③由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。〔三〕柠檬酸发酵生产工艺〔三〕柠檬酸发酵生产工艺〔三〕柠檬酸发酵生产工艺〔三〕柠檬酸发酵生产工艺二、柠檬酸提取生产工艺1、发酵液过滤：带式过滤机2、中和：滤液中除含柠檬酸外，还含可溶性的残糖以及蛋白质、金属离子等杂质。利用柠檬酸钙难溶于水的特点，与杂质别离的过程。3、酸解：中和所得钙盐经过滤、洗涤，与硫酸反应生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，过滤，滤液含较纯的柠檬酸。三、柠檬酸精制生产工艺1、离子交换：阳离子交换：主要除钙离子、铁离子；阴离子交换：主要除硫酸根、氯离子；2、蒸发浓缩：外循环减压蒸发，﹤65℃；3、结晶别离：高温连续或分批冷却结晶；4、枯燥包装：离心、沸腾枯燥、质检、装袋、封口。第四节污水的生物处理污水包括：1、水体的污染—富营养化；2、传染性病源体的污染；3、有毒化合物的污染；4、高分子难降解化合物的污染；5、重金属如铬、镉、铅、汞、硒等的污染；6、放射性物质的污染。污水生物处理的主要方向一、污水的生物处理的原理污水的生物处理：采用专门装置和设施，对含有污染物的污水进行厌氧和好氧处理，促进微生物的生长繁殖和代谢，使有机污染物彻底氧化，到达污水净化的目的。活性污泥法是有机污水处理的最常用的方法。二、污水的生物处理的根本方法污水净化中三级处理的主要步骤处理步骤 过程一级处理 通过沉淀、筛分、加明矾和其他凝絮剂以及其他物理方法去除水中不溶的颗粒二级处理 生物方法去除水中的可溶性有机物细流过滤活性污泥氧化塘延长通气