成纤维细胞分离方法

胰酶消化法1一、 取得小鼠胚胎性成熟母小鼠与种公鼠按1公（3）：2母（早）比例合笼。每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物（阴道栓）即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的0.5d。取怀孕12.5〜14.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下暴露子宫用镊子提起近子宫颈端，分离子宫系膜，剪断子宫角。取出整个子宫，置于有PBS的平皿内。用PBS洗涤三次，弃除表面残余血迹。沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS的平皿内，充分洗涤，弃除表面红细胞。用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜，用PBS洗涤三次。去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤三次，充分弃除红细胞。二、 取得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪（切）成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内。加适量胰酶，将离心管置于培养箱中10-20分钟取出离心管，反复吹打，加足量培养液终止消化。离心1000转，5分钟。弃掉上清，加适量培养液，反复吹打20次。分装到T75中，一般每2个胚胎可以制成一个T75的原代细胞。置37°C、5%CO2、饱和湿度培养箱培养。待细胞长3-7天细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可1：3-1：6传代。吸弃培养液上清。PBS（不含钙镁）冲洗两次。加0.125%胰酶-0.02EDT消化。在显微镜下观察，当少量细胞漂浮，贴壁的细胞层出现裂隙时，用移液管吹打冲洗瓶底5-6次。即刻加MEF培养液终止消化。1000转，5分钟离心。吸弃上清。加足培养液，吹打制成单细胞悬液，分装到各T75中。完成传代。原代细胞中还有少量组织块未被充分消化，在以后的每次传代过程中要尽量制成单细胞悬液，组织块会逐渐消失。原代细胞中混有一些杂细胞，一般传到第3代时，杂细胞逐渐减少。小鼠胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时，细胞互相交联，形态不典型。最多不超过六代。三、 MEF的冻存当细胞90%-100%融合时，尤其细胞少量堆聚可冷冻。处理方法同二的9-14，每75cm2的细胞加3ml冻存液重悬细胞。每个冻存管编号加1ml细胞悬液。置入程序降温盒-80C过夜，放入液氮长期保存。四、灭活MEF制备饲养层细胞取新的培养瓶，加0.1%Gelatin溶液覆盖预处理30分钟，用前吸掉Gelatin溶液。取需要处理的MEF细胞，以10ug/ml浓度加丝裂霉素(MitomycinC)混匀。置培养箱中3小时。吸弃废液。用DPBS洗5遍。处理方法同二11-14。处理过的MEF加适量培养液重悬计数，以3.0x104/cm2(MEF)铺在Gelatin处理过的培养瓶上置培养箱中静置过夜，使其贴壁。铺好的饲养层在1-7天内有效，都可以支持mES生长并维持其全能性胰酶消化法2一、 实验材料准备动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。最佳时间为E13.5d.(细胞增值能力比较快)试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.125%胰酶、0.53mmol/LEDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加15%FBS)器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50ml和15ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。二、 具体操作处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30mlD-PBS的50ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。用200〃的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15ml离心管中，于4°C1500rpm离心5分钟，倒掉上清，以10ml胰酶重悬沉淀，放在37°C水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。将上层细胞悬液倒入一个装有10mlMEF生长培养基的50ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1500rpm离心5分钟收集细胞，再用30mlMEF生长培养基洗涤两次。细胞沉淀用15mlMEF生长培养基重悬后进行细胞计数（一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞）。3x106细胞悬浮于15mlMEF生长培养基中，接种到200ml培养瓶中。24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化（此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟），按1:5传代。细胞再次长到覆盖率80-9