橙皮中黄酮类化合物的提取研究

毕业论文题目名称：橙皮中黄酮类化合物的提取研究学生姓名：院(系)：生命科学学院专业班级：指导教师：辅导教师：时间：目录TOC\o"1-2"\h\z\u毕业论文（设计）任务 Ⅰ开题报告 Ⅱ指导教师评审意见 Ⅲ评阅老师评语 Ⅳ答辩会议记录 Ⅴ中文摘要 Ⅵ英文摘要 Ⅶ1前言 11.1黄酮类化合物的结构与性质简介 11.2黄酮类化合物的生物活性 21.3黄酮类化合物的提取和测定方法的研究现状 41.4国内外的研究现状及发展趋势 51.5本课题研究的目的和意义 62材料与方法 72.1试验材料及药品 72.2试验主要仪器及设备 72.3试验方法 73结果与分析 83.1单因素实验 83.2黄酮提取工艺中影响因素的正交试验 124讨论与结论 14参考文献 14致谢 16橙皮中黄酮类化合物的提取研究[摘要]我国拥有丰富的柑橘资源，橘皮作为柑橘主要的副产物，约占果中的20%。本文主要以橙皮为原料，研究碱液提取黄酮类化合物的最佳工艺。通过单因素实验，考查浸泡时间、提取液pH、固液质量比、超声处理时间对黄酮得率的影响。单因素实验中各个因素的最优条件范围分别为22.5倍原料干重提取液，pH为11.0左右的石灰水，常温侵泡9h后，超声处理15min。连续提取3次，提取液需要用盐酸调节pH8.0-9.0长时间静置使溶解的果胶以果胶酸钙的形式沉淀，在过滤出去。然后再4000rpm下离心20min，大孔树脂吸附，分别取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2mL提取液经NaNO-Al(NO)3显色后，在波长510nm下测吸光度。并选用L(3)表进行正交试验，正交试验结果：最佳提取工艺为，浸泡时间8h、提取液pH为11.0、提取液体积45ml、超声处理时间15min时，黄酮提取率最高，为3.586%。影响黄酮提取率的最主要因子是提取液pH，最次要因子是超声处理时间。即黄酮的提取工艺影响程度为提取液pH>固液质量比>浸泡时间>超声处理时间。[关键词]橙皮，黄酮类化合物，提取，超声处理ToextractflavonoidsfromtheorangepeeloftheresearchStudent:Xujiangyan,CollegeofLifeScience,YangtzeUniversityTutor:SunWeiqing,CollegeofLifeScience,YangtzeUniversity[abstract]Ourcountryisrichincitrusresources,orangepeelasmainbyproductofcitrus,accountsforabout20%ofthefruit.Inthisstudy,lyewithorangepeelasrawmaterials,andoptimumprocessofextractingflavonoidsflavonoidspurificationresearch.Throughsinglefactorexperiment,thetestofsoakingtime,extractingliquidph,massratioofsolidandliquid,ultrasonictreatmenttimeontheyieldofflavonefromimpact.Themethodtoextractthebesttechnologyoforangepeelmediumyellowketonesubstanceis22.5timesthedryweightofextractrawmaterials,phofaround11.0limewater,coldinvasionbubbleafter10h,ultrasonictreatmentfor15min.Extracting3timesinarow,extractwithhydrochloricacidtoadjustpH8.09.0letstandforalongtimemakesdissolvedinpectinprecipitationintheformofpecticacidcalcium,thefilteredout.Getcontentinabout50%ofthecrudeproducts,rawandthendissolvedin50%isopropylalcohol0.1mol/LNaOHfilter,byuv-spectrophotometertomeasuretheabsorbancemeasurement,todeterminethebestextractionprocess.Orthogonalexperimentresults,Optimumextractionprocessfor,soaktime8h,extractpH11.0,fluidvolume45mlofextraction,ultrasonicprocessingtimeis15min.IsthemostimportantfactoraffectingflavonoidsextractionyieldofextractpH,thesecondaryisultrasonicprocessingtime.theextractionprocessofflavonoidsinfluencedegreeforthequalityofextractpH>solid-liquidratio>soakingtime>ultrasonicprocessingtime.[keywords]OrangepeelflavonoidsextractUltrasonicprocessing前言第1页（共16页）橙皮中黄酮类化合物的提取研究1前言1.1黄酮类物质的结构与性质概述黄酮类化合物是柑橘皮中含有的一类重要生物活性物质。柑橘中鉴定出来的黄酮类化合物有60余种，其主要成分是黄烷酮、黄酮，黄酮醇，它们大多以糖苷的形式存在。常见的有柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、芸香苷等二氢黄酮类。1.1.1黄酮类物质的来源黄酮类化合物广泛存在于植物的所有部分，包括根、茎、心材、树皮、叶、花、果实中。黄酮类化合物大多存在于一些有色植物中，如在甘草油性提取物、洋葱提取物、柑橘皮提取物、松树提取物、绿茶提取物、银杏叶提取物、红花提取物中都发现黄酮类化合物的存在,许多药食两用的植物中也存在多种的黄酮类化合物。我们日常摄取的食物中亦含有黄酮类化合物，下列食物中的含量较为丰富：洋葱、杨梅、芹菜、韭菜、洋葱、茶叶、番茄、蜂蜜、苹果、葡萄、荞麦叶、柑橘和柠檬、樱桃、青椒、可可豆、红葡萄酒等。1.1.2黄酮类物质的结构和分类黄酮类化合物是植物光合作用产生的一类重要的天然有机化合物，泛指由两个苯环(A环和B环)通过三个碳链相互连接而成的一系列化合物(C6-C3-C6)。根据中央三碳的氧化程度，B环连接位置，以及三碳链是否构成环状等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分类，分别是黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、花色素类等。1.1.3黄酮类物质的物理化学性质（1）黄酮类化合物的形态黄酮类化合物多数为结晶性固体，少数为无定型粉末。（2）黄酮类化合物的颜色在通常情况下，黄酮、黄酮醇及其苷类多呈灰黄至黄色，查耳酮为黄至橙黄色，橙皮中黄酮类化合物的提取研究第2页（共16页）而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类，因在分子结构中不存在交叉共扼体系，故不呈黄色，几乎为无色。花色素所显的颜色，随pH不同而改变，一般pH小于7显红色，pH等于8.5显紫色，pH大于8.5显蓝色。（3）黄酮类化合物的存在形式植物中的黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、连结位置及连接方式不同，可以组成各种各样的黄酮苷类。（4）黄酮类化合物的溶解性一般黄酮游离苷元难溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂和稀碱溶液中。黄酮类化合物的羟基被糖苷化后，水溶性增加，脂溶性降低，易溶于热水、甲醇、乙醇和稀碱溶液中，而难溶或不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等有机溶剂中，糖链越长，则水溶性越大。（5）黄酮类化合物的酸碱性黄酮类化合物因分子具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶中。同时其分子中Y-吡喃酮环上的1-氧原子，因有未共用电子对，故表现出微弱的碱性，可与强无机酸、生成盐类，该盐极不稳定，加水后即分解。（6）黄酮类化合物的显色反应黄酮类物质具有一些特征的显色反应:如盐酸一镁粉，氨水反应，结构中带有3-OH.5-OH或邻位羟基的黄酮类化合物，均能与金属盐类试剂如铝盐、镁盐、铁盐等形成颜色较深的络合物。各种黄酮类物质的颜色反应1.2黄酮类化合物的生物活性黄酮类化合物广泛存在于牧草、水果、蔬菜和药用植物中,植物长期自又选择过程中产生的一些次级代谢产物。迄今为止,在植物中已发现近10000种结构独特的黄酮类化合物。黄酮类化合物不仅结构样多,且不同类型的还表现出了不同的生物功能和活性。（1）抗氧化自由基作用老年性痴呆、震颤麻痹症、人类心脑血管疾病、肿瘤、老年性痴呆等疾病几乎都与氧自由基有关。合成的传统抗氧化剂有一定的毒性,可导致癌症、畸形，国外开始禁止使用一些合成抗氧化剂。而黄酮类化合物因其抗氧化活性强，毒副作用低，在自前言第3页（共16页）然界分布广现备受关注。黄酮化合物的抗氧化作用。表现以下几个方面:清除超氧化物、清除羟基自由基、抑制脂质过氧化、清除自由基。它的经基自由基清除能力由其结构所决定。（2）抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒活性生物类黄酮具有抗炎、抗过敏作用，抗炎机制可能在于其抑制了前列腺素(PG)生物合成过程中的脂氧化酶(LOX)，抗过敏机制可能不在于其改善靶器官和细胞的反应性，也不在于其竞争靶细胞受体从而拮抗生物活性物质，而可能在于其抑制抗原的结合或在抑制介质释放等环节上产生效应，临床上常用生物类黄酮药物治疗脓肿、溃疡和过敏等症。生物类黄酮还有抗菌、抗病毒活性，槲皮素、鼠李素、黄芩苷、木犀草素和石吊蓝苷等有抗菌活性，二氢槲皮素、山萘酚有抗病毒的活性，甘草查尔酮对HIV病毒有一定的抑制作用。红薯茎叶黄酮提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺杆菌、葡枝根霉和黑曲霉的有明显的抑制效果（3）护肝活性黄酮类化合物课调节人体免疫系统。保护细胞和护肝解毒的作用。其护肝机理,与黄酮类化合物的膜稳定作用可能有关,因为它能有效地抑制机体内的脂质过氧化反应,从而起到了解毒护肝的作用。（4）黄酮类化合物和维生素C在生物学系统中存在着相互作用的关系。如黄酮类化合物可以作为维生素C的抗氧化剂。植物黄酮类化合物可以显著地推迟维生素C被氧化成脱氢抗坏血酸的过程。其保护维生素C的作用机理主要为:①具有游离基受体的作用,和游离基结合,维生素C的氧化得到抑制。②可以和铜及其它微量金属发生螯合反应,继而延缓金属催化的维生素C的氧化反应，对维生素C在生理学上的作用主要表现在:①促进维生素C的吸收，②促进维生素C的稳定，③阻止维生素C被氧化，④减少维生素C的代谢。（5）雌激素作用黄酮类化合物具有雌性激素的兴奋和抑制双重效应。兴奋机制在于生物黄酮类化合物与雌激素受体的亲和性，雌激素样作用强度与亲和力强度相一致；抑制机制可能除了与雌激素受体有关外，还与子宫组织中的一种过氧化酶(该酶浓度随雌激素的加入而升高)有关，它直接抑制了多种酶活性。此外，黄酮类化合物与生长因子一样有促进生长的作用，它通过控制促性腺激素的释放或促性腺作用，阻碍雌激素代谢，提橙皮中黄酮类化合物的提取研究第4页（共16页）高雌激素活性等途径加快子宫的生长，从三叶草、大豆中得到的黄酮具有雌激素样作用。（6）抗癌活性黄酮类化合物主要通过3个途径达到抗癌、防癌作用，即抗自由基作用、直接抑制癌细胞生长和对抗致癌因子。致癌因子使体内产生自由基，并以自由基的形式富集于脂质细胞膜的周围，引起脂质过氧化，破坏细胞的DNA而致癌，黄酮类化合物是自由基碎灭剂和抗氧化剂，能有效阻止脂质过氧化引起的细胞破坏，起到抗癌、防癌的作用。牡荆素、桑色素、儿茶素和黄柏素具有较强的抗肿瘤和抗癌活性。特别是近年来,植物黄酮类化合物以其广谱的药理作用引世人瞩目。掀起了开发的热潮,随着对它研究工作的不断深入,研发出了一大批黄酮类药物。分子结构较复杂,作用位点较多,因而对一些病症的选择性和针对性缺乏,从而延缓了黄酮类药物的进一步开发和利用。因此,利用多学科交叉的优势,从大自然植物中不断寻找探索新作用机制的黄酮或新结构类型先导物,加强研究弄清其构效关系。再对先导化合物进行结构改造、结构优化或人工合成,使其具有高效性和针对性,必将对新药的幵发产生非常重大的影响。1.3黄酮类化合物的提取和测定方法的研究现状1.3.1黄酮类化合物的提取方法（1）溶剂提取法目前国内文献报道最多的黄酮提取法是在常压下用索氏提取器，常用的溶剂为乙醇或丙酮等，根据溶剂的极性不同，常用的提取方法有乙醇提取法，热水浸提法，乙酸乙酯提取法，常压溶剂提取法，高雅荣记提取法，氯仿提取法。此类方法简单，所需温度不高，某些易挥发，易失活的物质不易失活，但是提取时间过长，索氏提取器的优点是多次萃取，提高提取液中物质的浓度，缺点是过高的温度容易造成有效成分的氧化变质。（2）超声波提取法超声波是频率大于20kHz以上的声波，不能引起听觉，应用超声波强化提取植物中的有效成分，是一种物理破碎过程。超声波对媒质主要产生独特的机械振动作用和空化作用，其振动能产生强大的能量，给予媒质点以很大的速度和加速度，加速度前言第5页（共16页）随着声波频率的增大而增大，声波在植物组织细胞里，比电磁波穿透更深，停留时间也较长。高能量的超声波作用于液体使其被撕裂成很多小空穴，小空穴闭合时产生高达几千个大气压的瞬时压力，作用于细胞组织，加速原料中有效成分进入溶剂，增加有效成分的提取率。除了此作用外超声波还具有机械震动、乳化、扩散、击碎等多级反应，有利于使植物中有效成分的转移，并充分和溶剂混合，促进提取的进行。研究表明，超声波在提取植物活性物质方面取得了良好的效果，用超声波提取桔皮黄酮，甘草黄酮，黄芪黄酮，葛根黄酮，得到了较高的提取率。（3）石灰水提取法橙皮中分离出的主要黄酮化合物的化学结构中大都含有酚羟基，易溶于碱溶液，而在水中的溶解度小，尤其是橙皮苷在常温下的甲醇中的溶解度也比较小，而易溶解于碱性溶液，采用强碱提取法在提高提取率的同时，脂肪和果胶等物质的溶解度相应增加，产品杂质多，纯化困难。（4）超临界CO2流体萃取法超临界流体萃取就是利用某些溶剂在临界值以上具有的特性来提取混合物中可溶性组分的一门新的分离技术。目前人们使用最多的超临界CO2流体，该法需要配置昂贵的设备，仪器占地比较大，仪器维护复杂，但它具有产品纯度高，无溶剂残留，成分活性保持好等显著特点。现在已经从理论研究转向工业化生产，与国际应用接轨。1.2.2黄酮类化合物的常用测定方法黄酮类化合物的测定可分为定性和定量检测，定性分析方法主要有纸层析法、薄层层析法、波谱法等，定量检测方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等。1.4国内外的研究现状及发展趋势目前在我国，作为橙子加工业的副产品一橙皮和作为亚热带产量丰富的水果食用后的果皮一袖皮主要用作动物饲料和当作垃圾掩埋,这造成了自然资源的严重浪费和一定程度的环境污染。与发达国家相比,国内多数企业从橙皮皮中提取的色素、果胶含有大量的杂质和溶剂残留,达不到国外产品指标,在国际市场上价格远远低于平均价格,只作为半成品卖给国外技术成熟的公司进行精致,大量的利润转移出去；很多食品加工企业的果胶需要进口。国外己经开发处溶解性好的葡糖普橙皮普,使橙皮营的溶解性提高近一万倍。国内多数研究人员停留在对黄酮类化合物、类柠檬苦素粗制品的研究上,多数公司经营HLPC纯度的黄酮类化合物或它们的改性物多是国外产品。对癌细胞有很好抵抗作用的多甲氧基黄酮,价格昂贵,国内还没有纯度达标产品。另外,橙皮中含有丰富的类胡萝卜素,是很好的生理活性物质,它们价格不菲,是很有开发前途的产品。从橙皮中提取的辛弗林、橙皮昔已经作为药物应用于临床；黄酮类化合物可以改善饮料的品味,橙皮普氢化后产物的甜度是蔗糖1500倍；类似于银杏黄酮、大豆黄酮的保健品也已经在国内外市场上上市。欧美、日本、等国家或地区把黄酮类化合物、类柠檬苦素在清除人体内有害自由基、杀死癌细胞的药用研究看作医学界一个热点,美国研究者利用总黄酮的强抗氧化作用,已将它成功应用于功能性食品的开发中,目前已在全球销售。我国的很多大学、医院、研究所的科学工作者也己尝试这方面研究。1.5本课题研究的目的和意义黄铜类化合物是一种天然的抗氧化剂，具有很高的药用价值，如抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、消炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用。黄酮类化合物还在食品、化妆品、药品等行业中广泛应用。黄酮类化合物的抗氧化作用，主要表现为减少自由基的产生和清除自由基两个方面。一般情况下，还原能力与抗氧化能力呈正相关。测定物质的还原能力可以反映其抗氧化活性。自由基，从化学结构上看是指含未配对电子的基团、原子或分子。大量研究表明，由于自由基具有高度的化学活性，一方面它是机体有效的防御系统的一部分，在正常的情况下，体内自由基处于不断产生与清除的动态平衡之中，并在代谢中发挥着重要作用，参与一些酶和前列腺素的合成，增强白细胞吞噬活性，提高杀菌效果等。另一方面它又是造成许多疾病的原因，当人体内的自由基产生过多或清除过慢，就会攻击各种细胞、器官并使之受到损伤，加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。在众多自由基中，OH•是最活泼的，是对机体危害最大的自由基，它可和活细胞中的任何分子发生反应而造成损伤，而且反应速度极快，被破坏的分子遍及糖类、氨基酸、磷脂、核苷和有机酸等。O2－·的毒性是机体发生氧中毒的主要原因，由它引起的损伤表现在使核酸链断裂、多糖解聚及不饱和脂肪酸过氧化作用，进而造成膜损伤、线粒体氧化磷酸化作用的改变及其他一系列的变化。基于保护环境，充分利用资源，提高经济效益的理念。本研究中所用原料为橙子副产物—橙皮，橙皮的任意丢弃为环境也带来了巨大的压力，如果不能对橙子的副产物做好妥善的处理，这将成为制约橙子产业发展的瓶颈。将橙子的副产物—橙皮应用于工业生产提取生物黄酮，这在带来巨大的经济效益的同时，也缓解了环境的压力。本实验的目的是研究饱和石灰水法提取橙皮中黄酮类化合物的最佳工艺，掌握一些实验的思想，熟练一些实验操作的方法。加深人们对黄酮类化合物价值的认识。2材料与方法2.1试验材料及药品实验材料：橙子皮药品：饱和石灰水，盐酸，氢氧化钠，石油醚(30-60)，乙醚，乙醇，正丁醇，大孔树脂。2.2试验主要仪器及设备真空旋转蒸发仪郑州长城科工贸有限公司，R-1001N紫外一可见分光光度计日本岛津公司，UV一1700普通家用冰箱 中国海尔DHG-9023A电子热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司PL303电子天平上海精密科学仪器有限公司HHS-2S数显恒温水浴锅国华电器有限公司超声波发生器 KQ-250E型微型高速万能试样粉碎机 上海申生科技有限公司2.3试验方法2.3.1饱和石灰水提取橙皮中黄酮类化合物的工艺流程筛选好的柑橘皮→洗净→干燥→粉碎→加入饱和石灰水浸泡→超声处理→过滤→旋转蒸发→解吸→大孔树脂吸附→解吸→定容→测其吸光度→计算提取率2.3.2实验过程试验选定浸泡时间、pH值、固液质量体积比、超声时间四个因素来研究黄酮类化合物的溶解性。在每组试验中，用电子天平称量5份原料粉末于150ml广口玻璃瓶中，每份2.00g。然后加入饱和的石灰水调节pH值的一定体积、一定浓度的水溶液，静态浸泡，超声一段时间后，过滤。然后在4000rpm下离心20min，大孔树脂吸附，取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2mL提取液经NaNO-Al(NO)3显色后，在波长510nm下测吸光度。2.3.3黄酮含量的测定方法取芦丁标准液（0.115mg.ml）精确吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml置于25ml试管中,加5%亚硝酸钠0.3ml，放置6min,再加入10%硝酸铝0.3mL,放置6min,加入4%氢氧化钠4.0ml，加水至10ml刻度,摇匀。510nm处测定吸光值。以吸光值（A）为纵坐标y，芦丁质量浓度为横坐标x，绘制标准曲线(见图1)。得到芦丁质量浓度x与吸光度y关系曲线的回归方程为：y=8.3437x+0.0033，R=0.9932.（1）图1芦丁标准曲线提取液中总黄酮的含量测定：称取脱脂柑橘皮粉2.00g，提取完毕后，容量瓶定容至100ml，取2ml提取液测其吸光度，测定方法同上。根据公式（1）计算由标准曲线换得的总黄酮的浓度，计算公式：C=（2）y—单因素试验或正交试验中测得的吸光度（A）根据公式（2）计算提取液中总黄酮提取率，计算公式：W（%）= （3）W—柑橘皮总黄酮提取率（%）C—由标准曲线换算得的总黄酮浓度（mg/ml）2.3.4实验要点（1)浸泡时间浸泡时间的延长有利于柑橘皮细胞的破裂和黄酮类化合物的溶出。但时间太长,溶解的杂质含量增加，黄酮类化合物也容易发生氧化变质，所以选择密封条件下浸泡半天为宜。（2）提取提取液需要用盐酸调节pH8.0-pH9.0长时间静置使溶解的果胶以果胶酸钙的形式沉淀，再过滤除去。（3）超声处理时间超声处理时间不易太长这样仪器发热有损仪器，超声处理后期增长不明显得不偿失。3结果与分析3.1单因素实验3.1.1浸泡时间对黄酮提取率的影响称取相同质量的橙皮粉末5份各2.00g，设定提取液体积50ml，pH值11.0，超声时间15min，浸泡时间分别为1h，3h，6h，9h,12h。然后再4000rpm下离心20min，大孔树脂吸附，分别取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2ml提取液经NaNO-Al(NO)3显色后，在波长510nm下测吸光度。图2浸泡时间对黄酮提取液吸光度的影响从图可以看出,提取液的吸光度随着浸泡时间的延长一直增大,变化速度先是增大，后来减小。随着浸泡时间的增加，黄酮浸出量增加，浸泡时间增加到大约9h时由图课看出黄酮浸出量几乎没有增加，综合考最优佳浸泡时间范围为8h-10h。3.1.2提取液pH对黄酮提取率的影响称取相同质量的橙皮粉末5份各2.00g，设定提取液体积50ml，浸泡时间9h，超声处理时间15min，石灰水pH值分别为9.0，10.0，11.0，12.0，12.5，然后再4000rpm下离心20min，大孔树脂吸附，分别取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2mL提取液经NaNO-Al(NO)3显色后，在波长510nm下测吸光度。图3提取液pH值对黄酮提取液吸光度的影响由图课看出，pH值增大有利于黄酮类物质的溶出,大约在11-12之间达到最大，碱浓度过大反而使吸光度下降，原因可能是脂肪酸和果胶类物质的溶解影响了黄酮类物质的溶解性。综合考虑确定最优提取液pH范围为11.0-12.03.1.3固液质量比对黄酮提取效率的影响称取相同质量的橙皮粉末5份各2.00g，设定浸泡时间卫9h，pH值11.0，超声处理时间15min，提取液体积分别为30ml，45ml，60ml，80ml，100ml，然后再4000rpm下离心20min，大孔树脂吸附，分别取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2mL提取液经NaNO-Al(NO)3显色后，在波长510nm下测吸光度。图4提取液体积对黄酮提取液吸光度的影响由图可看出随着提取液体积的增大，吸光度有短暂的上升，随后下降趋于平稳，提取液体积增加到一定程度时，利于扩散的黄酮的提取率已经趋于稳定,有效成分已基本溶出，综合考虑最优提取液体积范围为30ml-50ml。3.1.4超声处理时间对黄酮提取效率的影响称取相同质量的橙皮粉末5份各2.00g，设定提取液体积50ml，浸泡时间9h，pH值11.0，超声处理时间分别为3min，6min，9min，12min，15min，然后再4000rpm下离心20min，大孔树脂吸附，分别取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2mL提取液经NaNO-Al(NO)3显色后，在波长510nm下测吸光度。图5超声时间对黄酮提取液吸光度的影响由图可看出，随着超声时间的延长，吸光度提高，而吸光度增长率在0min-5min最为明显。而超声处理一段时间后吸光度趋于平稳，这可能是由于时间太长后超声波产生的热量过多,且会降低质点间的能量传递。并且时间太长仪器过热影响使用寿命，综合考虑最优超声处理时间范围为13min-15min。3.2黄酮提取实验中影响因素的正交试验正交试验设计是研究多种影响因素的一种分式析因设计的主要方法，它根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行实验，这些点具备了齐整可比,均匀分散的特点。而单因素试验的结果存在一定的出入，根本原因在于单因素试验是在固定其他因素的前提下只考虑由某一因素的变化而带来的影响；而正交试验则是同时考察多个因素的影响，最终得到一组包含有各个因素的最优组合，结果全面，信息量大。在试验研究中，对于单因素或两因素试验，因其因素少，试验的设计、实施与分析都比较简单。但在实际工作中，常常需要同时考察3个或3个以上的试验因素，若进行全面试验，则试验的规模将很大，往往因试验条件的限制而难于实施。正交设计就是安排多因素试验、寻求最优水平组合的一种高效率试验设计方法。正交设计的基本特点是：用部分试验来代替全面试验，通过对部分试验结果的分析，了解全面试验的情况。正交试验设计是试验优化的常用方法。所谓试验优化，是指在最优化思想的指导下，进行最优设计的一种优化方法。它从不同的优良性出发，合理设计试验方案，有效控制试验干扰，科学处理试验数据，全面进行优化分析，直接实现优化目标，已成为现代优化技术的一个重要方面。本文采用3水平的L9(34）四因素三水平的正交试验确定最佳提取工艺。表1黄酮提取工艺中的影响因素和水平水平A浸泡时间/hB提取液pHC固液比D超声处理时间/min1810.02：40142911.02：451531012.02：5016表6正交试验表试验号ABCD吸光度A111110.760212220.920313330.810421230.780522310.800623120.860731320.730832130.790933210.950K12.4902.2702.4102.510K22.4402.5102.6502.510K32.4702.6202.3402.380k10.8300.7570.8030.837k20.8100.8370.8830.837k30.8230.8730.7800.793R0.0200.1160.1030.044由表5，6可看出，提取液pH对黄酮的提取影响最大，其次是固液质量比、浸泡时间，影响最小的是超声处理时间。既影响提取的主次因素为B>C>A>D。最佳因素水平为A1B3C2D2,即最佳提取工艺为浸泡时间8h、提取液pH12、体积45ml、超声处理时间15min。4讨论本研究以澄清石灰水为溶剂从橙皮中提取黄酮类化合物，以浸泡时间、提取液pH、固液质量比、超声处理时间为影响因素，在试验过程中发现提取时间太短，黄酮类化合物不能完全浸出，但是时间过长可能会由于长时间在强碱性环境下黄酮类成分遭到破坏，使提取率几乎没有增加；随着pH增大，提取率也增大，当pH增大到一定值之后，可以发现黄酮提取率有所下降，可能由于强碱性环境破坏了溶解平衡。随提取液体积的增加到，黄酮提取率有短暂的上升，随后下降趋于平稳，提取液体积增加到一定程度时，利于扩散的黄酮的提取率已经趋于稳定,有效成分已基本溶出；橙皮中黄酮提取率随着超声处理时间的增加而增加，显然超声处理有利于黄铜的提取，而超声处理一段时间后黄酮提取率趋于平稳，这可能是由于时间太长后超声波产生的热量过多,且会降低质点间的能量传递。5结论（1）单因素实验中各个因素的最优条件范围分别为22.5倍原料干重提取液，pH为11.0左右的石灰水，常温侵泡9h后，超声处理15min。（2）在正交试验中优组合为，浸泡时间8h、提取液pH为11.0、提取液体积45ml、超声处理时间15min。黄酮的提取工艺影响程度为提取液pH>固液质量比>浸泡时间>超声处理时间。优组合时，黄酮提取率最高，为3.586%。参考文献[1]陈复生，左锦静等.大孔树脂吸附和分离陈皮中黄酮类化合物的研究[J].食品科技.2006,7:121-124.[2]齐海鸥等.柑橘皮的综合利用[J].浙江柑橘,2003,20(3):31-35.[3]周大勇，徐青，薛兴亚等.高效液相色谱质谱一电喷雾质谱法测定积壳中黄酮普类化合物.分析化学研究报告[J].2006，（4）：31-35.[4]蓝航莲.柑橘类黄酮的生理活性和研究进展[J].2001.[5]岳红.超临界二氧化碳萃取柿叶黄酮的工艺研究[J].2005,25(3):55一58.[6]刘文娟，耿秋菊等.积实药材中总黄酮提取工艺的研究[J].时珍国医国药，2006,17（11）：2233-2234.[7]陈丛瑾，黄克瀛，李德良，等．植物中黄酮类化合物的提取方法研究概况[J]．生物质化学工程，2007，41(5)：42-45．[8]廖传华，超临界C02流体萃取技术[M].北京:化学工业出版社,2004，7（1）118-212.[9]何扩等.超临界流体萃取银杏叶中黄酮类化合物的研究[J].山西食品工业,2005,24(4):31-35.[10]刘均玉，许晨等.不同品种橘皮中的黄酮分析.中国食品添加剂[J],2008，vol.90，NO.52008:160.[11]胡燕飞，王