基因的分离与鉴定课件

基因的分离与鉴定基因的克隆包含着待研究的目的基因的分离和鉴定两个主要内容在真核生物中,单个基因仅占整个基因组的极其微小的比例。必须经过扩增(amplification)才有可能分离到含有目的基因的DNA片段。因此需要先构建基因文库(genelibrary)或叫DNA文库(DNAlibrary)。

DNA文库:来源于染色体DNA基因组,是来自单个基因组的DNA克隆片段汇总,包含基因组中所有DNA序列。cDNA文库:来源于基因组DNA的转录本(mRNA)再反转录成的cDNA拷贝,是单个基因组编码序列的cDNA克隆片段汇总,包含基因组中所有编码序列。

应用大肠杆菌作寄主进行外源DNA片段克隆的综合实验方案真核基因克隆的基本步骤5.1DNA克隆片段的产生与分离5.1.1基因组DNA的片段化(1)利用限制酶片段化基因组DNA的一般问题

获得外源DNA片段最简单的方法是鸟枪法(shotgunapproach):利用限制酶消化给体基因组DNA,不经过凝胶电泳分布分离,就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方法。此种方法的缺点是:载体上插入的外源片段大小不同,克隆群体庞大,不利于选择带有目的基因的克隆;当目的基因的核苷酸序列中有一个或数个限制酶识别位点时,需要好几个克隆才有可能获得目的基因的全序列。目的基因核苷酸序列越长,需要的克隆就越多;限制片段太大或太小都不利于正常基因文库的构建。

解决这些问题的方法有:限制酶局部消化;机械切割法等限制酶酶切片段的随机程度和大小与其识别序列长短有关:4bp:44=256bp;6bp:46=4096bp;8bp:48=65536随机程度高随机程度低(2)基因组DNA的双酶消化策略

1978年,有学者提出了利用两种限制酶混合消化基因组DNA的实验策略。应用这种方法可以获得适于克隆的随机片段化的DNA群体。

在进行局部的双酶消化后,可产生大部分为10~30kb范围的随机片段,它们之间存在着有效的随机的序列重叠现象。然后通过蔗糖密度梯度离心等方法得到20kb左右的随机的DNA片段群体,适于λ噬菌体载体的克隆能力。这样,经体外重组、包装和转化后,有把握获得足够多的重组体转化子克隆,构建成几乎完美、代表性的基因文库。在双酶消化策略中,可根据情况选择限制酶组合或具有同尾酶特点的单酶切──在克隆组合。5.1.2DNA片段的大小分布

构建完整的基因文库(DNA文库)时,并不需要对某种基因或DNA片段作特别的富集处理。但如果要克隆特定大小的含有目的基因的DNA片段时,可在克隆之前先对片段化的给体DNA群体进行按大小的分步分离,则可以显著提高克隆基因的分离频率。5.1.3编码目的基因的克隆片段的富集

如果克隆的目的是分离特定的基因,在对该基因的信息有所了解的情况下,可以通过凝胶电泳或蔗糖梯度离心等方法进行富集。但是,被克隆的目的基因的全序列应该在一条DNA片段上,所以,随机片段化的DNA不适于用此方法。举例:Qβ蛋白质(光合作用相关蛋白质)的psbA基因的克隆

将纯化的水稻叶绿体DNA(ctDNA)分别用BamHI、EcoRI及HindIII等限制酶局部消化,然后用含有溴化乙锭的1﹪琼脂糖凝胶电泳作分步分离;进行Southern印记转移,同32P放射性标记的目的基因探针进行杂交,结果表明,2.2kb的EcoRI片段、3.8kb的BamHI片段等含有psbA基因的编码序列;

根据这些结果,将对叶绿体DNA进行再一次的电泳分步分离,把2.2～2.5kb范围的EcoRI片段(含有psbA基因的编码序列)从低熔点胶中分离出来;在体外与pBR322质粒载体连接重组,转化大肠杆菌寄主细胞,构成水稻叶绿体基因组DNA的EcoRI文库;

从近200个转化子菌落中得到8个阳性克隆,其中有6个克隆带有2.2kb的插入片段,进一步分析后发现这些插入片段都含有psbA基因的编码序列。5.2重组体DNA分子的构建及导入受体细胞5.2.1外源DNA片段同载体分子的重组外源DNA片段同载体分子的连接需要限制酶与连接酶的作用。进行连接反应时,需要注意以下3点:

①实验步骤要尽可能简单易行;②连接形成的“接点”序列,应能被限制酶重新切割,以便回收插入的外源DNA片段;③有些情况下,对转录和转译过程中的密码结构的阅读不不发生干扰。(1)外源DNA片段的定向插入(2)非互补粘性末端DNA分子间连接①应用化学合成的衔接物构建粘性末端进行基因克隆的程序待克隆的DNA片段PstI衔接物T4多核苷酸激酶载体分子T4DNA连接酶转化与扩增克隆的DNA片段②应用BamHI接头构建重组体分子的基本程序BamHI接头分子外源DNA片段重组体质粒(3)最佳连接反应①防止线性载体DNA分子的自我环化,通用的3种方法:

A.用碱性磷酸酶除去线性载体DNA的5′-P,留下5′-OH;B.使用同聚物加尾技术;C.应用柯斯质粒进行克隆。②正确调整载体DNA和外源DNA之间的比例;③在体外连接反应中的DNA总浓度要高,低于20μgDNA/ml时,DNA分子间的相互作用机会少,不利于连接反应;而高浓度的DNA(300~400μgDNA/ml),则有利于连接反应;④连接反应的温度:26℃保温4小时所得到的转化子数大约是4℃保温23小时的90﹪,而且几乎是4℃保温4小时的25倍以上。DNA片段体外连接反应的保温时间及其温度对重组体转化效率的影响5.2.2重组体分子导入受体细胞的途径(1)重组体DNA的转化或转染

转化(transformation):感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达外源DNA片段或质粒载体DNA分子的生命过程。

转染(transfection):感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。①转化或转染的基本过程:

将外源DNA分子或与载体重组的重组体DNA分子同经过氯化钙处理的大肠杆菌感受态细胞混合,置冰浴中培养一段时间后,转入42℃水浴中作短暂的热刺激(热休克,一般90sec)。如果是转染,将这样处理的细菌直接涂布在琼脂平板上,使其形成噬菌斑;如果是转化,将这样处理的细菌放置在肉汤培养基中保温一段时间(复苏培养,约为1h),以便新表型得到表达,然后涂布在选择性培养基平板上进行培养。②转化或转染效率问题一般情况下,每微克pBR322质粒DNA可获得106左右的转化子菌落;每微克λ噬菌体DNA可获得104~106噬菌斑。转化(或转染)效率也同选用的大肠杆菌受体的菌株有关。当使用重组体DNA分子进行转化(或转染)时,频率要下降102~104,这是由于,一方面载体分子同DNA插入片段之间的连接效率低造成的,另一方面含有DNA插入片段的载体分子比较大,这本身会导致转化效率下降。我们可以用碱性磷酸酶处理法或环丝氨酸富集法等方法提高转化效率。(2)体外包装的λ噬菌体的转导5.3基因克隆的实验方案

从生物有机体中克隆某一特定DNA片段(或基因)的实验程序总称为基因克隆的实验方案或策略。根据实验目的和基因克隆各种要素的特点,选择正确的克隆方案是非常重要的.

例如,人的-

珠蛋白基因约为1.5kb,而人的单倍体基因组的总长度达3×106kb左右。那么究竟需要多少个长度为1.5kb的不同限制片段,才能够确保(即达到99﹪的必然性)在重组DNA转化子克隆群体中,至少含有一个是获得了这个基因的分子呢?也就是说一个完全的人类基因组DNA基因文库,究竟应包括多少个独立的克隆?这取决于基因组的大小和克隆的DNA片段平均大小两个参数。Clarke─Carbon公式给出的一个完全基因文库所需要的实际克隆数(1975年):

其中:N为一个完整基因文库所应包含的转化子克隆数;P为重组体群体中出现目的基因序列的几率(一般设定为99﹪);f为限制片段平均大小与基因组DNA总量之比。Clarke─Carbon公式可以被简化为:其中:G为基因组的大小;

f为插入片段平均大小对于上述提到的人的-

珠蛋白基因的例子,N的数值为:这说明,我们需要从9百万个独立的菌落或克隆中分离和鉴定人的-

珠蛋白基因,也就是说,我们必须有大量的重组体DNA群体,才有可能汇集整个人基因组的全部DNA序列。习惯上,将这种汇集着基因组所有DNA序列的重组体DNA群体称为基因文库(genelibrary)或基因库(genebank),更确切地说,应该叫DNA文库(DNAlibrary)。

如果改用λ噬菌体载体,比如克隆的插入片段平均长度为15kb,那么,一个完全的人基因文库所需要的重组体数量可减少到9×105;若用柯斯克隆,在克隆片段平均长度为40kb时,所需要的重组体数目又可减少到3.5×105。所以,我们一般选用噬菌体和柯斯质粒作载体,克隆大片段DNA并构建基因文库;用质粒载体克隆较小片段的DNA(＜15kb),它往往可以提供方便的检测手段。在决定选择何种克隆方案时,另一个值得考虑的重要因素是待克隆DNA分子的性质。如果是真核生物的基因全序列克隆,就应该使用基因组DNA材料;如果只是克隆编码氨基酸的表达序列,则可使用cDNA材料。

在pBR322质粒上克隆-珠蛋白的cDNA

加上了HindIII接头的β-珠蛋白cDNA重组到pBR322载体上以后,转化给大肠杆菌寄主细胞。将生长在Amp平板上的转化子菌落原位影印培养在Tet平板上,从中可筛选出AmprTets的菌落,此即含有β-珠蛋白cDNA插入的阳性克隆。5.3.1互补作用基因克隆用克隆片段与缺陷型受体细菌间的功能互补来克隆功能基因的常规方法。当缺陷型大肠杆菌菌株难以被转化时,可先转化含有F质粒的大肠杆菌菌株,然后通过F质粒为媒介,将重组体质粒导入众多的F－营养缺陷型菌株细胞。只适于克隆细菌基因和少数低等真核生物的相关功能基因。5.3.2cDNA基因克隆

真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列,所以,不论采取什么方法,都难以直接分离到目的基因片段。

部分生物的基因组DNA大小Human3.0x109Mouse3.0x109Drosophila1.1x108Yeast1.2x107Bacteria1.0-5.0x106

尽管高等生物一般具有几万个不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体都仅有15﹪左右的基因得以表达,产生出几千个不同的mRNA分子。可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂度要比直接从基因组克隆简单得多。

以质粒为载体构建cDNA文库:双链质粒DNA限制酶末端转移酶,dGTPmRNA把oligo(dT)引物加到poly(A)尾巴反转录酶用NaOH降解mRNA链,DNA聚合酶I以发卡环作引物合成互补DNA链SI核酸酶SI核酸酶降解发卡结构末端转移酶,dGTP插入质粒载体转化给大肠杆菌,扩增pBR322(1)cDNA文库的构建①分离总RNA,从中纯化出主要含mRNA的分部;②合成cDNA第一链(oligo(dT)引导的cDNA合成法、随机引物引导的cDNA合成法);③将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子(自我引导合成法、RNaseH酶降解取代法);④将合成的双链cDNA分子重组到质粒或噬菌体载体上,并导入大肠杆菌寄主细胞增殖。poly(A)mRNA与oligo(dT)杂交而被吸附,其它的tRNArRNA仍处于游离状态加入总RNA

oligo(dT)纤维素100mMNaCL洗脱下来的tRNA和rRNA10mMTris1mMEDTA收集洗脱下来的poly(A)mRNA用纤维素柱纯化poly(A)的流程示意图合成双链cDNA的RNaseH酶降解取代法以λ噬菌体作载体构建cDNA文库的流程图(2)不同丰度mRNA的cDNA克隆不同目的基因的mRNA在特定的生物体组织中的含量有很大的差别,相应的cDNA克隆策略也不同。①高丰度mRNA的cDNA克隆相对于低丰度mRNA的cDNA克隆,高丰度mRNA的cDNA克隆并不存在什么实际的问题。按常规方法进行cDNA克隆后,用菌落杂交技术,从转化的细菌群体中筛选出目的基因序列的重组体克隆即可。②低丰度mRNA的cDNA克隆通常是构建成cDNA基因文库。组成一个合理的完全的cDNA文库所必须的重组体克隆的数目,可根据Clarke─Carbon公式算出:

其中:p是得到完整cDNA文库的概率(通常设定为99﹪);是某一低丰度mRNA在mRNA群体中出现的概率;N是所需的克隆数。③稀少mRNA的cDNA克隆此种mRNA的克隆难度极大,主要采取一些特殊的技术才有可能取得成功。A.应用按分子量大小分部分离的技术富集克隆的mRNA;B.使用化学合成的寡聚脱氧核苷酸纯化特定的mRNA,也可采用根据氨基酸序列制备的混合探针来筛选cDNA文库的方法;C.用差别杂交法筛选特异mRNA的cDNA克隆(3)全长cDNA的合成用全长双链cDNA构建cDNA文库,分离目的基因,特称为全长cDNA克隆(full-lengthcDNAclone)。①oligo(dG)引导合成法A.第一链cDNA尚未与mRNA模板分离之前,先在其3′-末端加上一段oligo(dC)序列;B.然后通过碱性蔗糖梯度离心处理,使mRNA模板分子发生水解作用,回收全长cDNA;C.最后以互补的oligo(dG)序列作引物引导第二链cDNA的合成,这样就不会形成发卡环结构,也就没必要使用SI核酸酶进行切割处理。寡聚脱氧胸苷酸[oligo(dG)引导法合成全长双链cDNA②载体引导合成法第一连由参入到载体分子上的oligo(dT)序列引导合成;第二链也是由参入到载体分子上的oligo(dT)序列引导合成;产生出双链的重组体质粒分子以后,转化大肠杆菌寄主细胞,通过扩增可获得具有不同插入取向的cDNA克隆。超量变性的载体分子5′

③置换法合成全长cDNA制备带有一段oligo(dT)尾巴的质粒引物和具有oligo(dG)尾巴的接头DNA;前者引导合成第一链cDNA。构建质粒-cDNA重组体分子,然后用RNaseH酶解取代法合成第二链cDNA。转化大肠杆菌寄主细胞。(4)cDNA克隆的优点和用途①优点:A.对于研究增殖过程并不经过DNA中间体的有些RNA病毒,cDNA克隆是唯一可行的方法;B.cDNA文库的筛选比较简单易行;C.由于每一个cDNA克隆都代表一种mRNA序列,在选择中出现假阳性的几率比较低cDNA②用途:A.克隆在细菌中表达的基因;B.用作基因序列结构的测定;C.有关在发育过程中时间调节基因的表达特征的分析。5.3.4基因组DNA克隆cDNA克隆的局限性

(1)cDNA只反映mRNA的分子结构,而并不包括基因组DNA的间隔序列;(2)cDNA基因文库中,不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态,而mRNA的分布与其丰度相关的。(3)cDNA克隆不能够克隆到基因组DNA中的非转录区段的序列,因而无法满足对基因编码区外侧调控序列的结构与功能的研究。基因组DNA克隆的优越性(1)能有效地满足外源真核基因在真核细胞中的表达;(2)具有所有基因的序列拷贝;(3)能够满足对基因非编码区结构与功能的研究。(1)应用λ噬菌体载体构建基因组文库①通过衔接物连接法在λ噬菌体载体上构建基因组文库

a.加入HaeIII-AluI对真核基因组DNA作局部双酶切,分部分离20kb左右的片段;b.EcoRI甲基化酶处理,再连EcoRI衔接物;

c、d.用EcoRI消化目的DNA和载体;e.按大小分部,除去载体中间区段;

f.插入片段与载体分子退火连接(连接酶);g.体外包装;

h.感染大肠杆菌细胞寄主细胞,构成基因组文库。高分子量真核基因组DNA取代性λ噬菌体载体Charon4A②用Sau3A消化真核基因组DNA在λ噬菌体载体上构建基因组文库a.载体DNA片段的制备;b.真核基因组DNA的制备;c.体外重组构建多连体分子;d.体外包装;e.感染大肠杆菌寄主细胞。B=BamHI末端S=Sau3A末端(2)应用柯斯质粒载体构建基因组文库

应用λ噬菌体载体克隆外源DNA的真正有效范围仅有15kb左右,而许多真核基因的长度比这大的多,有的长达1000kb。由于柯斯质粒可携带的外源DNA比λ噬菌体载体克隆能力的3倍,所以,柯斯质粒载体更适合于克隆真核基因。柯斯克隆一般程序:①用限制酶Sau3A局部消化基因组DNA,然后分离收集长度为35～45kb的片段群体;②同Sau3A的同尾酶,例如用BglII消化为线性化的柯斯质粒载体DNA连接重组;③经体外包装之后,感染大肠杆菌寄主细胞;④在大肠杆菌细胞中柯斯质粒载体按质粒的特性进行复制扩增,形成基因组文库。柯斯克隆的缺点:①用噬菌斑杂交法筛选λ噬菌体重组体的基因文库,比用菌落杂交法结果更加清晰噬菌斑杂交出来的本底,一般总要比菌落杂交产生的本底低得多;②用λ噬菌体载体构建的基因文库,经扩增后几乎可以无限期地保存,而含有重组体柯斯质粒的细菌,经过贮藏之后,其成活率会剧烈地下降。

任何一种方法扩增的基因文库中,并不是所有的成员都是等速增殖的。因为插入的外源DNA片段的大小及序列上的差异,将影响到重组的噬菌体、质粒或柯斯质粒的复制速率,这样,当一个基因文库经过扩增之后,某些特定的重组体的比例可能增加,而有些重组体的比例则可能下降。5.3.4基因定位克隆基因定位克隆是用于分离其编码产物尚不知道的目的基因的一种有效的方法。基本步骤:①将目的基因(目的基因的突变)定位到染色体上,并在目的基因两侧确定一对紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记;②利用最紧密连锁的一对分子标记作探针,通过染色体步移技术将位于这两个分子标记之间的含目的基因的特定的基因组片段克隆并分离出来;③根据其同突变体发生遗传互补的能力从此克隆中鉴定出目的基因。(1)拟南芥菜简介在植物分子生物学研究中,一种小型有花植物──拟南芥菜是具有其他植物所不具备的许多优点:①植物个体小:一间不大的实验室里可种植上万株的实验材料;②时代时间短;约为5周,一年内可收集到8～9个世代的遗传数据;③种子产率高:每个植株可产生4×104粒以上的种子;④基因组小、结构简单:总长度为7×107bp。比大肠杆菌基因组大20倍,却只要棉花的10﹪、烟草的5﹪、小麦的1﹪,单一序列比例高,是玉米的120倍。适合于用染色体步移技术克隆目的基因;⑤天然自花受粉,所以新的突变体都是天然的纯合子。便于通过人工杂交受粉进行基因定位。

所以,拟南芥菜被称为植物王国中的果蝇(2)RFLP分子标记所谓的RFLP是指DNA限制片段多态性:不同生态型或地理隔离群的同源DNA分子之间表现出序列趋异性,结果,可能使限制酶识别位点的突变而引起限制位点的增加或减少,形成RFLP。(3)RFLP作图原理与步骤(拟南芥菜)探针A代表基因A;探针B代表基因B。C:Columbia生态型N:Niederzenz生态型探针A探针B探针B探针A探针A探针BF1杂合子F2杂代I.A和B不连锁II.A和B紧密连锁探针B探针B探针A探针A子代子代×(4)染色体步移技术RFLP克隆目的基因(a)构建起始克隆的限制图;(b)亚克隆B-H片段;(c)用放射性标记的亚克隆B-H片段,从基因组文库中筛选具重叠序列的新的一步克隆;(d)构建一步克隆的限制图;(e)亚克隆H-E片段;(f)用放射性标记的亚克隆H-E片段,从基因组文库中筛选具重叠序列的新的二步克隆。如此反复多次重复步骤(a)～(c),逐步逼近,直至得到目的基因的克隆。图中的B、E、H:B:BamHIE:EcoRIH:HindIII值得注意的是:①分子探针必须是唯一序列;②插入到克隆载体上引起致死效应的序列无法克隆的。(5)大尺度基因组物理图谱的构建

基因组的1cM图距,在人类基因组中大约相当于1000kb的DNA长度,在拟南芥菜、番茄和小麦中分别相当于290kb、750kb和3500kb。而且大多数高等生物中存在大量的散在重复序列,这使得如果克隆的基因组DNA片段越长,染色体步移时出现的难度越大;反之,又会影响探针标记的强度,从而降低检测的灵敏度。

对于农作物的RFLP研究中,一般选用400~2000kb长度的DNA片段构建随机的基因组文库。显然,常规的克隆技术是无法承受如此大片段的DNA,下面我们就学习解决的办法。①DNA分子大片段切割

对于DNA分子大片段切割,一般采用切割位点稀少的限制性内切酶。比如我国科学家强伯勤院士首先发现的限制酶SfiI,其识别序列是5′─GGCCNNNN↓NGGCC─3′。目前商品化供应的切割位点稀少的限制酶已有数十种,常见的有NotI、SfiI和PacI等,已经广泛应用与大尺度的基因组物理图谱的构建。

另外,哺乳动物的基因组DNA中,除了CpG岛外,CG二核苷酸对是十分少见的。因此,一些识别序列短,却含有CG二核苷酸对的限制酶,例如,NruI(TCG↓CGA)和BssHII(G↓CGCGC)等,在哺乳动物基因组DNA中的识别位点是稀少的。可用来切割产生大分子量的限制片段。

限制酶DpnI可在序列处切割DNA分子,形成平末端片段。当修饰甲基化酶M·TaqI对限制酶TaqI的识别序列TCGA进行甲基化,使其变成时,限制酶DpnI只能在8核苷酸序列处发生切割作用。修饰甲基化酶M·ClaI对限制酶ClaI的识别序列ATCGAT进行甲基化,使其变成时,限制酶DpnI只能在10核苷酸序列处发生切割作用。这说明,结合使用一些甲基化酶和限制酶,有可能产生若干具有额外特性的靶子位点,可获得大片段DNA分子。②大片段DNA分子的分离

应用常规的琼脂糖凝胶电泳难以分离长度超过50kb的DNA片段。而脉冲电场凝胶电泳(PFGE)可以分离长度范围200~3000kb的大片段DNA分子。基本步骤:

ⅰ.将研究材料的细胞埋藏在低熔点琼脂糖中;ⅱ.加入有关酶及反应试剂,从细胞蛋白质和RNA混合物中游离出DNA。因为在凝胶基质中的DNA分子较少发生断裂;ⅲ.用适合于产生大片段DNA的限制酶在低熔点琼脂糖中进行消化;ⅳ.被限制酶消化了的DNA的凝胶块直接埋在凝胶槽中进行电泳,低压脉冲过夜或几天以后可得到长达百万bp的大片段DNA。

目前可以用倒转电场凝胶电泳(FIGE)的方法可以避免PFGE因为使用正交电场而引起的DNA谱带扭曲变形的缺点。因为FIGE使用的是周期性的180°交变电场,DNA分子是按直线轨迹泳动的。③YAC库的构建

酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)作为载体可以克隆数百kb的大分子量DNA片段。YAC载体的组成包括:ⅰ.来自酵母染色体的着丝粒序列;ⅱ.一段控制酵母DNA复制的自主复制序列(ARS);ⅲ.一对酵母的端粒序列,有的来源于四膜虫染色体;ⅳ.选择记号;ⅴ.克隆位点。

YAC载体能够象染色体一样在酵母细胞中正常复制,并可以克隆大到1mb的大片段DNA分子。○○○在经过一次脉冲电场凝胶电泳,把含有插入片段的YAC载体分离出来转化已去掉细胞壁的酵母细胞④大尺度物理图谱的构建

遗传图中,基因间或分子标记间的遗传图距是以重组频率来测算的,而在物理图谱中,其分子标记间的物理图距是以核苷酸的数目来表示的。物理图谱可以通过PFGE法进行构建。

拟南芥菜基因组DNA长度为7×104kp,如果每个基因组克隆长度为40kb,相邻克隆之间重叠序列长度为5kb,那么要完全覆盖全部染色体DNA,则至少需要2000个克隆。所以,构建全基因组物理图谱,虽然从原理上讲是十分简单的,但实际上是一项非常庞大而可怕的工程。构建全基因组物理图谱及克隆库的基本程序

以拟南芥菜为例,14个重叠的基因组克隆可以覆盖全部染色体DNA的一条小型染色体。图中竖线表示限制酶的切割位点。该图中是根据具有共同的限制位点模型对基因组克隆进行排列的。

5.4克隆基因的分离

近年来分离目的基因的技术取得了长足的发展,这与如下三个因素有直接的关系。第一、人类基因专利事件──Watson与Healy之争;第二、农业生产实践的压力;第三、染色体DNA全序列测定工作的局限性。

同时,有些科学家对基因组全序列测定的必要性提出了疑义:①具有理论研究或生产应用价值的基因仅占基因组全序列的极少部分;②基因组的大部分序列并无重要的生物学功能;而且一两个个体的基因组全序列并不含有多态性的基因信息;③基因组全序列测定工作耗资巨大,发展中国家无法承受;④农业生产和医疗临床实践都迫切需要尽快分离出有关的目的基因。5.4.1应用核酸探针分离克隆的目的基因(核酸杂交筛选法)(1)核酸探针的来源①根据mRNA的丰度,从cDNA文库入手制备探针;②从进化中保守的核苷酸编码序列入手,制备探针;③从同一蛋白质家族中的保守的氨基酸序列入手,逆向推导合成寡核苷酸探针库;(2)寡核苷酸探针的人工合成在从蛋白质氨基酸序列入手合成寡核苷酸探针时,需要克服2个方面的困难:

①为了保证足够的特异性,通常使用17～20个核苷酸长度的探针,也就是说,需要掌握6个以上连续排列的氨基酸组成的蛋白质序列的数据;②为了克服遗传密码简并问题,尽可能选择简并性最低的一段由6个氨基酸组成的蛋白质序列,作为合成寡核苷酸探针的依据。(3)假阳性克隆的克服①猜测体探针:用于分离克隆基因的低简并性的人工合成寡核苷酸探针。

如果猜测体探针83﹪的核苷酸能够同目的基因cDNA序列杂交,并有10~12个连续、完全配对的区域,就可以鉴定出含目的基因的cDNA阳性克隆。②PCR猜测体技术(尿酸氧化酶编码基因的分离)(a)PCR扩增产物同质粒载体重组后转化大肠杆菌菌株;(b)应用中间部位的猜测体探针作菌落杂交;(c)从阳性克隆中分离重组体质粒DNA;(d)从重组体质粒DNA中切下插入序列供作杂交探针筛选cDNA文库;(e)挑取含全长尿酸氧化酶基因cDNA的阳性克隆,供进一步研究使用。5.4.2应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因(1)差别杂交

根据不同细胞群体mRNA差异,分别用cDNA探针对含有特异基因表达序列的cDNA文库进行杂交,分离克隆的目的基因。(a)从表达和不表达目的基因mRNA的2个细胞群体中分别制备总mRNA;(b)以oligo(dT)或短的寡核苷酸随机引物,将总mRNA反转录成放射性标记的探针;(c)碱水解法除去RNA链;(d)用每种探针分子分别与cDNA文库杂交,该文库是由表达目的基因的细胞总mRNA构建的。(2)扣除杂交

除去非目的基因的cDNA克隆或DNA序列,富集欲分离的目的基因之cDNA克隆或DNA序列的杂交方法。

比如,T细胞受体基因TCR只能在T细胞中表达,而不能在B细胞中表达。从T细胞制备来的单链cDNA同大大超量的B细胞的mRNA进行杂交,于是所有互补的序列都能形成DNA-RNA杂交分子,而T细胞特有的cDNA由于B细胞中没有相应的mRNA而仍然保持单链状态;将此种杂交混合物通过羟基磷灰石柱,使DNA-RNA杂交分子结合在柱上,回收过柱流出的单链cDNA;将其转变为双链cDNA后,与适当的λ噬菌体载体重组并转化大肠杆菌寄主细胞,这样便得到了T细胞特异的cDNA高度富集的扣除文库;制备cDNA探针,筛选文库,分离T细胞的TCR基因。

扣除杂交法分离克隆的目的基因(缺失突变基因)(a)野生型及突变型DNA的切割,后者用生物素标记成探针;(b)DNA变性并与生物素标记探针杂交;(c)过生物素结合蛋白质柱;将过柱流出的DNA收集,多次重复步骤(b)~(c);(d)PCR扩增DNA片段B;(e)连续转化形成克隆库。最后用Southern杂交法进一步鉴定出不能同突变型DNA杂交的含有突变基因的阳性克隆。5.4.3应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因

根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为2大类:

①看家基因(house-keepinggene):以其组成性表达模式维持细胞的基本代谢活动的基因。②发育调控基因(developmentalregulatedgene):以其时空特异性表达模式完成个体的正常的生长、发育与进化的基因。基因的差别表达(differentialexpression)

在生物个体发育的不同阶段,或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序表达的方式

1992年,美国学者P.Lliang和A.D.Pardee根据基因的差别表达这一特性,发明了mRNA差别显示PCR技术,简称DDRT-PCR(differentaldisplayreversetranscriptionPCR)。(1)mRNA差别显示的原理①3′端锚定引物

几乎所有的真核基因mRNA分子3′-末端都带有一段多聚腺苷酸结构,即poly(A)尾巴。那么这段poly(A)序列起点之前的(5′上游)的2个碱基,在不考虑倒二位为A的情况下,只能有以下12种可能的排列组合:

5′-AGAAAAA…AA-3′5′-ATAAAAA…AA-3′5′-CGAAAAA…AA-3′5′-CTAAAAA…AA-3′5′-GGAAAAA…AA-3′5′-GTAAAAA…AA-3′5′-TGAAAAA…AA-3′5′-TTAAAAA…AA-3′5′-ACAAAAA…AA-3′5′-CCAAAAA…AA-3′5′-GCAAAAA…AA-3′5′-TCAAAAA…AA-3′根据这种序列结构的特点,设计合成12种不同的下游引物,称为3′锚定引物,其结构通式为:

5′-T11MN或5′-T12MN其中,M为除了T以外任何一种核苷酸;N则为任何一种核苷酸。所以,MN有12种不同的排列组合方式。锚定引物用来反转录mRNA,合成第一链cDNA。这样,每一种锚定引物都将把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。由此可知,使用一套5′-T11MN或5′-T12MN引物,可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成具有序列结构差异的12份亚群体。②5′端随机引物

为了把不同发育阶段的目的基因分离出来,在PCR扩增时,还需要一种10个核苷酸组成的5′端随机引物,这种引物,可以与特定细胞类型的总mRNA群体的cDNA互补位点发生杂交作用,而这种互补位点是分布在距每条新合成的cDNA链3′-末端的不同位点上的。用3′锚定引物和5′随机引物组成的引物对,对总mRNA进行PCR扩增的结果,可以将在不同发育阶段或不同基因型材料中基因表达的差别以cDNA标签的形式显示出来。此时,凝胶上的谱带显示了以cDNA为标签的基因表达情况,如果不同材料之间的谱带有差异,就说明着不同材料中基因表达的差异。而每个条带都代表着一种特定的mRNA。

(2)DDRT-PCR基本步骤ⅰ.分别从A组和B组提取总mRNA;ⅱ.加入3′锚定引物进行反转录合成第一链cDNA;ⅲ.加入一对特定组合的3′锚定引物和5′随机引物,以及35S-dNTP进行PCR扩增;ⅳ.将同位素标记的PCR产物加样在变性的DNA序列胶中作电泳分离,并进行放射自显影;ⅴ.将有关差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来;ⅵ.用相同的引物对进行第二次PCR扩增,得到一定数量后,再作重组克隆;ⅶ.将克隆的特定DNA分别同基因组DNA及总mRNA作杂交或测序;鉴定出可能是目的基因的DNA片段;ⅷ.用此目的DNA作探针,从基因组文库或cDNA文库中筛选全长克隆;ⅸ.对筛选出的阳性克隆进行核苷酸序列结构分析及功能鉴定,获得差别表达的目的基因。(3)mRNA差别显示法的优点和不足优点:

ⅰ.可以同时比较多个样品间基因表达的差异;ⅱ.可以同时检测“上游”和“下游”基因;ⅲ.检测灵敏度高,所需样品少;ⅳ.由于用了PCR和序列胶电泳,更加简单方便。不足:

ⅰ.假阳性比例高,可高达50~75﹪,一方面,由于泳动速率相同,长度一样的多种PCR扩增产物混合在一条带中;另一方面,邻近条带间的距离很近,在根据放射自显影底片来确定特异条带位置时容易出现操作误差。ⅱ.扩增的差别条带分子长度比较短小,一般只有110~450bp之间。ⅲ.绝大多数差别显示的条带都仅仅含有3′-UTR的一短片段的信息,而这样的序列与基因的编码区来说是比较保守的,根据这样的序列制备的探针,在进行northern分析时容易出现假阳性。5.4.4应用表达文库分离克隆的目的基因

由于众所周知的原因,真核基因不能在大肠杆菌细胞中进行表达的。通常选用表达载体来解决这一难题。表达载体中,外源DNA片段插入后在可调节的原核启动子之下,能够在大肠杆菌细胞中准确地转录和表达出外源蛋质。(1)把cDNA克隆到表达载体上,构建cDNA表达库,表达的蛋白质是融合蛋白质,而且不被细菌细胞中有关蛋白酶消化降解。通过对蛋白质产物的鉴定,分离克隆的目的基因。把原处平板上的噬菌斑及其产生的融合蛋白质影印到硝酸纤维素滤膜上滤膜与第一抗体溶液温育漂洗滤膜除去未结合的第一抗体。加入放射性标记的第二抗体放射自显影硝酸纤维素滤膜(2)通过测定蛋白质的功能来筛选cDNA表达文库

在存在着Ca++离子的情况下钙调蛋白(calmodulin)能够同许多种酶结合形成稳定的复合物。因此,放射性同位素标记的钙调蛋白可以用作一种筛选cDNA表达文库的分子探针,从中鉴定出能够表达可在体外同钙调蛋白结合的目标蛋白质的阳性克隆。(3)用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的DNA片段作探针筛选cDNA表达文库

利用这种方法,从cDNA表达文库中鉴定出与它发生特异性结合的目标蛋白质的阳性克隆。这种方法在真核基因表达调控的研究中十分有用。尤其是用于分离与启动子元件特异性结合的转录因子的编码基因方面具有良好的效果。5.4.5酵母双杂交系统(参见《现代遗传学》186页相同内容)

许多真核生物的转录激活因子都是有结构上可以分开、功能上相互独立的结构域组成。

DNA结合结构域(bd)转录激活结构域(ad)目的蛋白基因X与编码bd的DNA序列人工重组成X-GAL4ad;将另一个已知的蛋白质基因与编码bd的DNA序列人工重组成X-GAL4bd,克隆以后分别产生杂合蛋白,如果X与Y相互作用,在共同转化的酵母细胞中回产生有功能的转录激活因子,下游基因便可表达。5.5重组体分子的选择与鉴定外源DNA片段与载体分子连接的反应体系中,包括了:ⅰ.不带有外源DNA片段的载体自我环化片段;ⅱ.载体与不同数目外源DNA片段连接构成的重组体子;ⅲ.不同数目外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子等多种类型的DNA分子。

由这种混合的DNA制剂转化而来的克隆群体中,我们首先需要采用特殊的方法才能筛选出可能含有目的基因片段的重组体克隆;然后还要用某种方法检测这些筛选的重组体克隆中是否确实具有一段插入的外源DNA片段;最后必须进行认真的选择和鉴定,从这些转化子克隆中分离出真正含有目的基因的重组体克隆。5.5.1遗传检测法(1)直接选择法──根据载体的表型特征选择重组体分子

根据载体分子携带的遗传标记或表型特征来选择的一些方法①抗药性记号插入失活选择法(以pBR322为例)②β-半乳糖苷酶显色反应选择法(pUC系列载体)β-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖β-半乳糖苷酶异构乳糖乳糖1、β-半乳糖苷酶对乳糖的消化作用(上图)2、β-半乳糖苷酶使乳糖成为异构乳糖,异构乳糖是β-半乳糖苷酶基因表达的诱导物(下图)。在基因工程实验中所使用的诱导物是IPTG,所用的显色剂是X-gal。pUC18和pUC19质粒载体的MCS结构(2)根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法如果插入在载体分子上的外源基因能够在大肠杆菌寄主细胞中实现其功能性的表达,我们就可以根据其表型特征进行直接选择。

其基本原理是:转化进来的外源基因能够对带有缺陷(如营养缺陷型)的大肠杆菌寄主菌株发生体内抑制或互补效应,从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。目前已有相当数量的对其突变作了详尽研究的大肠杆菌实用菌株。而且有些类型的突变,只要外源基因产物获得低水平的表达便会抑制或发生互补作用。5.5.2物理检测法

在有关DNA序列结构的研究中,需要将DNA序列中的非基因编码区的片段也克隆到质粒载体上。根据重组体载体比野生型载体大这一特点,就可以检测出来。(1)凝胶电泳检测法

转化工作之后,将含有质粒的单菌落的溶菌物,通常一次制备12个不同单菌落的溶菌样品,同时进行凝胶电泳分析测定。在细菌染色体DNA前面会出现独立的质粒DNA电泳谱带。在不同单菌落溶菌样品的电泳结果的分析中,就可以根据野生型质粒和重组体质粒DNA的迁移率的差异而鉴定出含有重组体质粒的阳性克隆。(2)R-环检测法

在临近双链DNA变性温度下和高浓度(70﹪)甲酰胺溶液中,双链的DNA-RNA分子要比双链的DNA-DNA分子更为稳定。因此,将RNA及DNA的混合物置于这种退火条件下,RNA便会同双链DNA中的互补链退火形成稳定的DNA-RNA杂交分子,而被取代的另一链处于单链状态,这种由单链DNA分支与双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体称为R-环结构。

在有利于形成R环的条件下,使待检测的纯化的质粒DNA,在含有mRNA分子的缓冲液中局部地变性,如果质粒DNA分子上存在着与mRNA探针互补的序列,那么这种mRNA就将取代DNA分子中的相应的互补链,形成R环。然后在电子显微镜下观察,便可以检测出重组体质粒的DNA分子。5.5.3菌落或噬菌斑杂交筛选法

应用放射性标记的特定的DNA或RNA作探针,进行DNA/DNA或DNA/RNA杂交检测法。具体步骤参见第二章相应内容。5.5.4免疫化学检测法

用抗体鉴定那些产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑的方法。只要克隆的目的基因能够在大肠杆菌寄主细胞中实现表达,合成出外源的蛋白质,就可以采用免疫化学法检测重组体克隆。这种方法突出的优点是能够检测不为寄主细胞提供任何选择特征的克隆基因,但需要使用特异性的抗体。(1)放射性抗体检测法(2)免疫沉淀检测法现今医学分为传统医学、基于“生物-医学模式”近代发展起来的西医，20世纪西医又发展到“社会-心理-生物医学”或综合医学模式，后基因组时代系统生物学的兴起，形成了系统医学在全球的迅速发展，成为继传统医学、西医学之后中、西医学汇通的未来医学。当代中国医学类专业比较优秀的学校有北京大学、华中科技医学化验医学定义（medicine），是处理人健康定义中人的生理处于良好状态相关问题的一种科学，（高血压心脏病糖尿病）以治疗预防生理疾病和提高人体生理机体健康为目的。狭义的医学只是疾病的治疗和机体有效功能的极限恢复，广义的医学还包括中国养生学和由此衍生的西方的营养学。现在世界上医学主要有西方微观西医学和东方宏观中医学两大系统体系。医学的科学性在与应用基础医学的理论不断完善和实践的验证，例如生化、生理、微生物学、解剖、病理学、（肺炎青霉素肝炎）药理学、统计学、流行病学，中医学及中医技能等，来治疗疾病与促进健康。虽然东西方由于思维方式的不同导致（高血压心脏病糖尿病）研究人体健康与外界联系及病理机制的宏观微观顺序不同，但在不远的将来中西医实践的丰富经验的积累和理论的形成必将诞生新的医学---------人类医学。（肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）不同于现代医学，不同于传统中医，（传染病丙肝乙肝甲肝）金水医学诞生了，金水医学是以驱除病理，恢复生理为主张的全新医学，走出了人类医学的误区，（肺血液血小板红血球白血球）治疗疾病的特色鲜明，不论是任何疾病都能做到从危为安，由重到轻的恢复办法。金水医学认识到人体是生命体，生命体有自己的强大的生理自我愈合功能，（高血压心脏病糖尿病）帮助生命体恢复自主作用才是治疗疾病的根本。针对当今现代文明病，现代疑难病，现代慢性病，亚健康，一体多病，取得了巨大的成功，治疗法则为“胃肠洁，气血流，玄府开，营卫昌”人生命体运动符合自然节律，最终达到人体生理增强，消灭疾病的目的。（肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）编辑本段医学的分类医学研究医学可分为现代医学（即通常说的西医学）和传统医学（包括中医学、（高血压心脏病糖尿病）藏医学、蒙医学等）多种医学体系。不同地区和民族都有相应的一些医学体系，宗旨和目的不相同。印度传统医学系统也被认为很发达。（传染病丙肝乙肝甲肝）研究领域大方向包括基础医学、临床医学、检验医学、预防医学、保健医学、康复医学等。（肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）基础医学包括：医学生物数学,医学生物化学,医学生物物理学,人体解剖学,医学细胞生物学,人体生理学,人体组织学,人体胚胎学,医学遗传学,人体免疫学,（肺血液血小板红血球白血球）医学寄生虫学,医学微生物学,医学病毒学,人体病理学,病理生理学,药理学,医学实验动物学,医学心理学,生物医学工程学,医学信息学,急救学,护病学,新中心法则。（肺炎青霉素肝炎）临床医学包括：临床诊断学实验诊断学.影像诊断学+放射诊断学+超声诊断学+核医诊断学*临床治疗学职能治疗学化学治疗学生物治疗学血液治疗学组织器官治疗学饮食治疗学（高血压心脏病糖尿病）物理治疗学语言治疗学心理治疗学内科学外科学泌尿科学妇产科学儿科学老年医学眼科学耳鼻喉科学口腔医学传染病学皮肤医学神经医学精神病学肿瘤医学急诊医学麻醉学护理学家庭医学性医学（传染病丙肝乙肝甲肝）临终关怀学康复医学保健医学听力学。（肺炎青霉素肝炎）编辑本段医学的起源

医学教材东、西方文化历史背景是中、西医学形成、发展的土壤。公元2世纪东、西方的两位医学巨匠张仲景和盖伦，传承了不同的学术思想，创建了迥异的医学范式，发展和完善了不同的理论体系，使中、西医学各自走向了（高血压心脏病糖尿病）两条完全不同的发展道路。在汉代医学家张仲景所著述的《伤寒杂病论》之前，就有《内经》、《难经》、《本草经》等古典医药典籍。张仲景总结了汉代以前的医学成就，继承了《内经》等基本理论和丰富的医药（传染病丙肝乙肝甲肝）知识，结合自己的临床实践，写成了《伤寒杂病论》。其贡献在于确立了中医学辨证论治的理论体系，为后世中医临床医学的发展，奠定了坚实的基础。（肺炎青霉素肝炎）在西方，盖伦的一生生活在罗马帝国时安东尼父子的执政期。彼时，罗马帝国的繁荣，为盖伦的医学成就、以及西方医学的昌盛，提供了可靠的政治、经济、科技和文化保证。盖伦继承希波克拉底的学术思想，（肺血液血小板红血球白血球）著述200余部著作，现存的83部著作中，内容涉及解剖、生理、病理、卫生、药物、《希波克拉底文集》研究、哲学、语言学、逻辑学、数学、历史、（传染病丙肝乙肝甲肝）法律等。倡导实证医学，他的科学（高血压心脏病糖尿病）方法论具有重视实验、疾病局部定位思想、重视形式逻辑、强调演绎法等特点，对后世西医学的发展影响深远。中、西医学在张仲景和盖伦完全相悖的医学范式引导下，开始步入了分道扬镳的历史进程。在中华文化强调“中和”的大背景下，学术界便有了“海纳百川”的宽松气氛。出现了学术流派精彩分呈，如瘟病的寒温之争，经方时方之别等。中医学按张仲景的思维范式，蓬蓬勃勃的发展起来了。（传染病丙肝乙肝甲肝）随着科学的进步和社会的发展特别是医疗实践的发展，最初的中医学理论已无法诠释新的科学事实，因此，医学理论必须不断创新，（高血压心脏病糖尿病）才能适应社会需要，这就促使中医学进入汉代以后，呈现出全面发展的阶段，这个阶段共包括四个时期：编辑本段魏晋隋唐时期（肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）由于重视总结临床经验，并继承整理发挥《黄帝内经》、《伤寒杂病论》等经典医著的理论，出现了众多名医名著。如晋代王叔和的《脉经》和皇甫谧的《针灸甲乙经》、隋代巢元方的《诸病源候论》、唐代孙思邈的《千金要方》和《千金翼方》。（肺炎青霉素肝炎）编辑本段宋金元时期我国经济和科学技术日益发展，学术文化领域百家争鸣，特别是思想家的革新精神，为中医学理论的创新和突破性进展，提供了有利的文化背景。宋代陈无择著《三因极一病证方论》一书，提出三因学说；并产生了最具盛名四大学派，（肺血液血小板红血球白血球）刘完素倡导火热论；张从正力倡“攻邪论”；李杲提出“内伤脾胃，百病由生”的理论；朱震亨创造性（高血压心脏病糖尿病）地阐明了相火的演变规律。编辑本段明清时期是中医学理论综合汇编、深化发展，临床各科辨证体系丰富、提高阶段。如明代楼英的《医学纲目》和王肯堂的《证治准绳》，清代吴谦等编著的《医宗金鉴》和陈梦雷主编的（传染病丙肝乙肝甲肝）《古今图书集成·医部全录》等。王清任著《医林改错》，注重实证研究，纠正了古医籍中关于解剖知识的某些错误，肯定了“脑主思维”，（肺炎青霉素肝炎）发展了瘀血理论。温病学说的形成和发展，标志着中医理论的创新与突破，吴有性著《温疫论》，叶天士著（高血压心脏病糖尿病）《温热病篇》，吴鞠通著《温病条辨》等，在药物学研究方面，李时珍著的《本草纲目》，总结了16世纪以前我国药物学研究的成就。（肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）而西方医学随着西罗马帝国的灭亡，逐渐进入了中世纪的千年黑暗，科学变成了神学的奴婢，牧师取代医师。（传染病丙肝乙肝甲肝）从13世纪开始，始渐复明，直到15世纪，冲破封建宗教藩篱，才得以迅速发展。达·芬奇开创现代解剖学，维萨里创立解剖生理学；1731年意大利摩尔干尼创立了病理解剖学；1855年德国魏尔啸创建了细胞病理学；与此同时西方科学方法论对医学发展具有指导作用。以实验为主的实证方法(观察实验和比较分析)、及对医学研究中的“经院哲学”的彻底决裂、依靠各门自然科学所提供的技术手段和方法，（肺血液血小板红血球白血球）培养了医学家们的科学意识，赋予了医学的自然科学属性，使其摆脱了思辩推理的玄想而成就了生物医学模式（传染病丙肝乙肝甲肝）下的实验科学。（高血压心脏病糖尿病）至此中医学在实证医学领域已无法于西医同日而语。但中医学相对于西医学的优势是从宏观入手，注重整体，强调局部与局部、局部与整体之间的联系，重视辨证，主张“三因治宜”的个体化诊疗方略等。编辑本段东西方医学差异（肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）中、西医学运用不同的思维模式诊治疾病，其基本理论各成体系并有（传染病丙肝乙肝甲肝）根本差异。中西医学的差异不仅仅是有否实证的科学理念，最主要的是两种文化体系的差别。从理论上讲，中西医学是两种不可能统一的医学体系。“中体西用”曾成为中西医汇通派的指导思想，但由于两种医学的根基不同，硬在中医之体上套上西医之用，近一个世纪的事实证明，“汇通医学的体用判断脱离了中西医学的事实认识，以价值认识代替了事实认识，决定最终结果劳而无功”，因此，中、西医学应并存共荣而不必强求统一。（肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）尽管目前中、西医学还不可能融合成为一种统一的医学模式，但可以独立发展，并存共荣，整合互补。缘于现代信息论、系统论和控制论的影响，西医学的发展趋势若仅仅是单纯地重视分析而忽略了（传染病丙肝乙肝甲肝）整体结构和整体功能，无疑将渐行渐窄。而中医讲究“感悟”，未免夹带有很多主观因素，（肺血液血小板红血球白血球）难以客观地定量，定性。若中医的诊察疾病能参考现代医学的微观分析，将辨证与辨病相结合，实现宏观与微观的统一，使中医诊断客观化，即把分析与综合相结合的方法引入中医理、法、方（高血压心脏病糖尿病）、药的研究，使二者有机结合（肺炎青霉素肝炎），互相借鉴、补充，避免各自的片面性、局限性，这将有利于中西医学的优势互补，“和而不同”，多元发展。近年来，中医药在防治非典、禽流感和艾滋病方面发挥的独特作用也证实了二者的有机结合，具有肯定的临床疗效。编辑本段东西方医学交融（传染病丙肝乙肝甲肝）不管是中医学还是西医学，从二者现有的思维方式的发展趋势来看，均是走向现代系统论思维，中医药学理论与现代科学体系之间具有系统同型性，属于本质相同而描述表达方式不同的两种科学形式。可望在现代系统论思维上实现交融或统一，（高血压心脏病糖尿病）成为中西医在新的发展水平上实现交融或统一的支撑点，希冀籍此能给中医学以至生命科学带来良好的发展机遇，进而对医学理论带来新的革命。编辑本段现代中医史（肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）上个世纪末,本世纪初，1996年,清华学界对中医气本质，经络实质，阴阳，五行，藏象，中医哲学观等都有了新的全面整体创造性的认识和解说。如，邓宇等发现的:气是流动着的‘信息－能量－物质’的混合统一体；（传染病丙肝乙肝甲肝）分形分维的经络解剖结构；数理阴阳；中医分形集：分形阴阳集－阴阳集的分形分维数，五行分形集－五行集的分维数；分形藏象五系统－暨心系统、肝系统、脾系统、肺系统、肾系统；中医三个哲学观－新提出的第三哲学观：相似观－分形论等。（肺血液血小板红血球白血球）还包括近代针灸经络的发展史,近代中医气的进展简史,中西医结合史,中医中药史等.古代(经典)中医史（肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）中国的中医学起源于三皇五帝时期，相传伏羲发明了（传染病丙肝乙肝甲肝）针灸并尝试草药。在公元前3000多年，中国的轩辕黄帝写下了人类第一部医学著作——《祝由科》，后世人在这部医药著作的基础上不断增补删改，逐渐形成了后来的《黄帝内经》和《黄帝外经》，并由祝由科里将纯粹的医药分离了出来，形成了后来的中医学。而其中的《黄帝内经》则在世界上（高血压心脏病糖尿病）第一个提出了“不治已病治未病”这一防病养生保健康的预防医学观点。（肺炎青霉素肝炎）轩辕黄帝早在周代(公元前1046年（肺血液血小板红血球白血球）－公元前771年)就建立了世界上第一个医院和医疗制度，周代的医疗机构设有医师、上士、下士、府（管药库）、史（管记录）、徒若干人。下面又分食医（管饮食卫库）、疾医（内科）、疡医（外科）、兽医四种，这是世界上最早的医学分科。医师总管医药行政，并在年终对医生进行考核；《周礼》记载“岁冬则稽其事，以制其食”，就是说，医生每年都要通过年终考核增减俸禄。（传染病丙肝乙肝甲肝）当时的患者已经分科治疗，而且建立病历。（高血压心脏病糖尿病）“死终则各书其所以，而入于医师”，（肺血液血小板红血球白血球）规定在死者病历上要写明死因，然后送交医师存档，以便总结医疗经验，提高医疗技术。这也是世界上最早的病历制度。在春秋战国（公元前770年－前221年）时期名医辈出，（肺血液血小板红血球白血球）秦国有名医医缓，齐国有长桑和他的徒弟扁鹊。扁鹊发明了中医独特的辨证论治，并总结为“四诊”方法，即“望、闻、问、切”。扁鹊看病行医有“六不治”原则：一是依仗权势，骄横跋扈的人不治；（肺血液血小板红血球白血球）二是贪图钱财，不顾性命者不治；三是暴饮暴食，饮食无常者不治；四是病深不早求医者不治；五是身体虚弱不能服药者不治；六是相信巫术不相信医道者不治。后世则尊称他为神医扁鹊。春秋战国时流行的主要医学著作有《黄帝内经》、（高血压心脏病糖尿病）《黄帝外经》、《扁鹊内经》、《扁鹊外经》、《白氏内经》、《白氏外经》和《旁篇》这七本，（传染病丙肝乙肝甲肝）合成“七经”。（肺炎青霉素肝炎）在秦朝（公元前221年—公元前207年）出现了世界上最早的专门法医——"令史"。秦律规定，死因不明的案件原则上都要进行尸体检验，司法官如果违法不进行检验，将受到处罚。秦代的《封诊式》对法医鉴定的方法、程序等有较为详细的记载。在人命案件中，鉴定检验的主要内容有尸体的位置、创伤的部位、数量、方向以及大小等。（肺血液血小板红血球白血球）令史检验完成之后，必须提交书面报告，称为“爰书”，是世界上最早的法医鉴定和现场勘察报告。秦代还在世界上第一个建立传染病医院——“疠迁所”，（高血压心脏病糖尿病）并制定了最早的治疗传染病的隔离制度。据1975年湖北省云梦睡虎地出土秦简中记载：当时规定，凡经医生在给病人检查后发现有鼻梁塌陷、手上无汗毛、声音沙哑、刺激鼻腔不打喷嚏等症状者，一律送至疠迁所隔离治疗。（传染病丙肝乙肝甲肝）这说明中国古代对传染性疾病的治疗措施，很早就已经是得力有效的。到了西汉时期(公元前202年－公元8年)，中医的阴阳五行理论已经非常完备，名医则有太仓公淳于意和公乘阳庆。东汉出现了著名医学家张仲景和华佗。张仲景完善了中医的辨证理论，他还是世界上第一个临床医学大师，被尊称为医圣。他著有（高血压心脏病糖尿病）《伤寒论》《疗妇人方》、《黄素方》、《口齿论》、《平病方》等等医书，最终流传下来的医书被并被后人编纂为《伤寒杂病论》和《金匮要略》。张仲景采用辨证论治的基本原则，在《伤寒论》中归结为“八纲辨证”和“六经论治”，经由这两种方法辨证论治后，再采用“八法”（汗、吐、下、（传染病丙肝乙肝甲肝）和、温、清、补、消）治疗疾病。“八纲辨证”是书中贯彻辨证论治的具体原则，所谓“八纲”（阴、阳、表、里、寒、热、虚、实）是运用“四诊”（望、闻、问、切）分析和检查疾病的部位、性质而归纳出来，“六经论治”是整个脏腑经络学说在临床医学上的具体运用。东汉末年，华佗则以精通外科手术和麻醉名闻天下，华佗是世界上（高血压心脏病糖尿病）第一个使用麻醉术进行手术的人，他发明的麻沸散是世界上最早的麻醉药物，还创立了世界上最早的健身体操“五禽戏”。可惜华佗所著医书的（肺血液血小板红血球白血球）《青囊书》最后被付之一炬。在汉代，大量的医药和历算等书籍传入西藏（《西藏王统记》记载）。在汉代还出现了专门性的妇科医院，西汉时的“乳舍”，是世界上最早的妇产医院。（肺炎青霉素肝炎）南北朝时期(420年－589年)问世了世界上最早的两本儿科专著，即王末钞的《小儿用药本草》和徐叔响的《疗少小百病杂方》。南朝宋元嘉二十年(公元443年)，（传染病丙肝乙肝甲肝）太医令秦承祖创建了世界上第一个医学院。到了公元6世纪，隋朝完善了这一医学教育机构，并命名为“太医署”，署内分医、药两部，太医令是最高官职，丞为之助理，下有主药、医师、药园师、医博士、助教、按摩博士、祝禁博士，（高血压心脏病糖尿病）在校师生最多时达580人之多。（肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）在唐朝（公元618年－907年），孙思邈总结前人的理论并总结经验，收集药方多达5000多个，出版了《大医精诚》、（肺血液血小板红血球白血球）《千金要方》和《千金翼方》三本医学著作，后世尊称他为药王。唐朝以后，中国医学理论和著作大量外传到突厥、高句丽、日本、中亚、西亚等地。（传染病丙肝乙肝甲肝）到了在唐末宋初，儿科专著《颅囟经》问世流行，而世界医学史上第一个著名儿科专家钱乙（公元1032－1113年）则受此书启发，撰写了著名的儿科巨著《小儿药证直诀》，后人把钱乙尊称为“儿科之圣”，“幼科之鼻祖”。北宋时期（960年－1127年），宋政府设立翰林医学院即太医局，医学分科已经非常完备，并且统一了中国针灸穴位，出版《图经》。北宋的宋慈出版了世界上最早的法医学著作（高血压心脏病糖尿病）《洗冤集录》。（肺炎青霉素肝炎）在明朝（1368年－1644），著名医学家李时珍的医学巨著《本草纲目》成书，这本书不仅是药物学专着，还包括植物学、动物学、（传染病丙肝乙肝甲肝）矿物学、化学等方面的知识。《本草纲目》刊行后很快传入日本、朝鲜及越南等亚洲地区，（肺血液血小板红血球白血球）在公元17、18世纪先后被翻译成多种欧洲语言。另一方面，李时珍是世界上第一个提出