抗菌药物最低抑菌浓度的测定

■=j最抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）的测定实验目的：通过采用常量稀释法，检测几种抗菌药物对A8、A9、D5菌株的最小抑菌浓度（MIC）,对临床诊断用药有指导作用。【试剂与器材】试剂⑴主要仪器设备：三角烧瓶、高压灭菌器、内径90mm平皿、试管、0.5麦氏标准比浊管、天平、接种环、吸头、微量加样器、胶布、分光光度计、酒精灯等。⑵试验药品：培养基基础粉（酸水解酪蛋白/酸水解酪素、牛肉浸膏粉、淀粉、琼脂）、纯水（蒸馏水）、电炉、牛皮纸、线、抗菌药物、无菌生理盐水、蒸馏水、pH6.00.1mol/L磷酸盐缓冲液。⑶试验菌株：A8、A9、D5菌株、标准株大肠杆菌。在肉汤或琼脂中将抗菌药物进行一系列（对倍）稀释后定量接种待检菌，35°C孵育一定时间后，观察抑制待检菌肉眼可见生长的最低药物浓度，即为该药物对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）。【试验方法】肉汤稀释法试管稀释法（常量稀释法）【原理】用MH肉汤将抗菌药物作不同浓度的稀释，再接种待检菌，定量测定抗菌药物抑制或杀灭待检菌的最低抑菌浓度（MIC）。【操作步骤】抗菌药物原液制备：配制抗菌药物原液的溶剂和稀释剂大多采用蒸馏水、pH6.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液等。抗菌药物贮存液浓度不应低于1000Ug/ml（如1280ug/ml）或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。公式为：质量（mg）二溶剂（ml）x浓度（ug/mg）/分析效能（ug/mg）容积（ml）二质量（mg）x分析效能（ug/mg）/浓度（ug/mg）例如：需配制100ml浓度为1280ug/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750ug/mg。用天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6mgX750ug/ml）/1280ug/ml=107.0ml，然后将182.6mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。原液配制好后过滤除菌，小量分装备用。大部分抗菌药物原液一60C保存时间不超过6个月，在一20C以下可以保存3个月，而4C只能保存1周。稀释法中常用的抗菌药物容积的稀释，见表1。表1稀释法中常用的抗菌药物容积稀释法

药物浓度(ug/ml)取药液量(ml)加稀释剂量(ml)药物稀释浓度(ug/ml)琼脂或肉汤中最后含药浓度(ug/ml)药物：琼脂(或肉汤)二1：95120105120512512011256025651201312801281280116406412801332032128017160161601180816013404160172022011101201350.520172.50.252.5111.250.1252.5130.60.062.5170.30.03药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。表2常用药敏纸片待检菌药物金黄色葡萄球菌ATCC25923苯唑西林、青霉素、克林霉素、万古霉素、环丙沙星、庆大霉素、复方新诺明大肠埃希菌ATCC25922氨苄西林、头孢唑林、庆大霉素、头孢吠辛、环丙沙星、亚胺培南铜绿假单胞菌ATCC27853头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、阿米卡星、氨曲南、环丙沙星、亚胺培南试验方法:用记号笔在培养基上标记待检菌名。在己分纯的待检菌培养基上取4个〜5个菌落，接种在4ml〜5ml水解酪蛋白(MH)肉汤中，置35°C培养4h〜6h，链球菌、嗜血杆菌等需用加血的肉汤增菌并孵育过夜。增菌后的菌液用3ml〜5ml无菌生理盐水或肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准。做常规药敏试验也可采用直接菌悬液法。即直接取过夜培养的待检菌菌落数个，置于生理盐水或肉汤中制备接种菌液，校正浓度至0.5麦氏比浊标准。校正后的菌液应在15min内接种完毕。用无菌棉拭子蘸取己校正浓度的菌液，在试管上端内壁旋转挤压几次，去掉多余的菌液。在MH琼脂表面均匀涂布接种数次，每次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂抹1周。对链球菌、肠球菌等营养要求高的细菌，应使用含5%脱纤维羊血的MH琼脂。接种后的平板在室温中干燥3min〜5min，使培养基表面的水分吸收。然后用无菌镊子取含药纸片，轻压，使其紧贴在琼脂表面，纸片贴后不应再移动。各纸片中心相距应大于24mm，纸片中心距平板内缘应大于15mm。贴上纸片后，须在15min内置35°C孵箱，孵育16h〜18h，某些细菌需延长孵育时间至24h〜48h。苛养菌应在含有CO2的环境中孵育。用精确度为0.1mm的游标卡尺测量抑菌圈直径，参照表3的标准判读结果。质量控制标准菌株应与待检菌在相同条件下做药敏试验，标准菌株的抑菌圈应落在表4所示的预期值范围内。如果超出该范围，则不应发出报告，需及时查找原因，予以纠正。表3纸片法药敏试验纸片含药量和结果解释抗菌药物纸片含药量抑菌圈直径（mm）耐药中介敏感青霉素类氨苄西林肠杆菌科10ug<1314〜16N17葡萄球菌10ug<28—N29苯唑西林葡萄球菌1ug<1011〜12N13青霉素G葡萄球菌10ug<28—N29哌拉西林假单胞菌属100ug<17—N18头孢菌素类头孢唑琳30ug<1415〜17N18头孢他啶30ug<1415〜17N18头孢呋辛30ug<1415〜17N18其他B-内酰胺类氨曲南30ug<1516〜21N22亚胺培南10ug<1314〜15N16氨基糖苷类阿米卡星30ug<1415〜16N17庆大霉素其他革兰阳性杆菌10ug<1213〜14N15

多肽类万古霉素肠球菌30ug<1415〜16N17其他革兰阳性杆菌30ugW910〜11N12哇诺酮类环丙沙星5ug<1516〜20N21其他类克林霉素2ug<1415〜20N21复方新诺明1.25/23.75ug<1011〜15N16表4质控标准菌株的抑菌圈允许范围抗菌药物纸片含药量抑菌圈直径（mm）大肠埃希菌ATCC25922金黄色葡萄球菌ATCC25923铜绿假单胞菌ATCC27853氨苄西林苯唑西林氨苄西林/舒巴坦青霉素G哌拉西林头孢唑琳头孢他啶头孢呋辛氨曲南亚胺培南阿米卡星庆大霉素万古霉素环丙沙星克林霉素复方新诺明10ug1ug10/10ug10ug100ug30ug30ug30ug30ug10ug30ug10ug30ug5ug2ug1.25/23.75ug16〜22—20〜24—24〜3023〜2925〜3220〜2628〜3626〜3219〜2619〜26—30〜34—24〜3227〜3518〜2429〜3726〜37—29〜3516〜2027〜35——20〜2619〜2715〜2922〜3024〜3024〜32一一一一25〜33一22〜29一23〜2920〜2818〜2616〜21一25〜33一一培养基的制备使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。1、 称取3.3g培养基基础粉于250ml三角烧瓶中；2、 量取纯水（蒸馏水）100ml，倒入三角烧瓶中，轻摇至均匀；3、 将三角烧瓶内的混合物加热至沸腾，使培养基完全溶解；4、 将三角烧瓶，瓶口用铝箔纸封住或用牛皮纸扎住，放入高压灭菌器中，在121°C下，高压15分钟；5、 将高压灭菌结束的三角烧瓶取出，让其降温至50C。将液体培养基倒入到一次性平皿中待用。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%(W/V)氯化钠。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%〜5%溶解马血的MH肉汤。增菌培养有2种方法配制接种物，链球菌、嗜血杆菌需在MH肉汤中加入补充营养成分：是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白(MH)肉汤中，35C孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水^H肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1〜2X108CFU/ml。是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18〜24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1：100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。稀释及测定细菌的浓度增菌后的菌液用3ml〜5ml生理盐水校正浓度至0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤1:10稀释(含菌量为107CFU/ml)，稀释后的菌液应在15min内接种完毕。具体操作：0.5麦氏比浊管配制方法：0.048MBaCL2(1.17%W/VBaCL2.2H2O)0.5ml0.36NH2SO4(1%,V/V)99.5ml用麦氏比浊法测定细菌的浓度的方法为：1、 轻摇标准试管。2、 无菌操作将被测定的肉汤培养物加到与标准管相同直径(大小)的无菌试管中。3、 以无菌操作向被测定试管加入无菌生理盐水(NaCl)，直到浓度与所要求的标准管的浓度相同。稀释抗菌药物的制备及菌液接种取试管26支，排成两排，每排13支。用MH肉汤稀释抗菌药物原液至拟测最高浓度，可参照表1所示的稀释方法进行操作。除每排的第1支试管外，每支试管内加MH肉汤2ml，分别在每排的第1支和第2支试管内加2ml抗菌药物稀释液，第2管混匀后吸出2ml加入第3管中，依次对倍稀释至第13支管，吸出2ml弃去。如此，各管抗菌药物的最终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.12、0.06、0.03ug/ml。用微量加样器取0.1ml待检菌稀释菌液，由低药物浓度到高药物浓度依次加入第一排各试管中，标准株的大肠杆菌菌液加入第二排各试管中，则每管最终接种菌液浓度为5X1053FU/ml。加样时加样器吸头必须插到管内液面下加菌，注意避免与管内壁接触，菌液加完后试管勿晃动。孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置35°C普通空气孵箱中孵育16h〜20h后观察结果；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20h〜24h；检测葡萄球菌、肠球菌对苯唑西林、万古霉素的药敏试验需孵育24h以上。苛养菌需在含有CO2的环境中孵育。结果判断与解释在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。每次药敏试验时应根据待检菌种类，选用不同的标准菌株，与待检菌在相同试验条件下同步测定，常用抗菌药物对标准菌株的MIC值应在NCCLS允许的预期值范围内，见表5。若测试结果超过或低于预期值范围一个稀释度以上，不应向临床发出报告。应查找原因，及时纠正。根据NCCLS推荐的分界点值标准，判断耐药(resistant,R)、敏感(susceptible,S)或中介(intermediate,I)。S表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效，禁忌症除外。R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制，或属于具有特定耐药机理(如B-内酰胺酶)，

所以临床治疗效果不佳。I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度，疗效低于敏感菌。还表示被测菌株可以通过提高剂量(如B-内酰胺类药物)被抑制，或在药物生理性浓集的部位(如尿液)被抑制。另外，中介还作为“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控，所导致较大的错误解释【参考范围】表5稀释法质控标准菌株MIC预期值范围(ug/ml)抗菌药物金黄色葡萄球菌(ATCC29213)粪肠球菌(ATCC29212)大肠埃希菌(ATCC25922)铜绿假单胞菌(ATCC27853)青霉素G苯唑西林甲氧西林氨苄西林哌拉西林头孙塞吩头孢唑琳头孢呋辛头孢他啶头孢唑肟氨曲南庆大霉素阿米卡星克林霉素红霉素万古霉素环丙沙星0.25〜1.00.12〜0.50.5〜2.0-0.12〜0.50.25〜1.0--0.12〜1.0-0.06〜0.250.12〜0.50.5〜2.00.12〜0.51.0〜4.0-0.5〜2.0-----1.0〜4.01.0〜4.00.25〜2.0--2.0〜8.01.0〜4.04.0〜161.0〜4.02.0〜8.00.06〜0.50.03〜0.120.06〜0.250.25〜1.00.5〜4.0-0.004〜0.015--1.0〜4.0-1.0〜4.016〜642.0〜8.01.0〜4.02.0〜8.0-0.25〜1.0【临床意义】试管稀释法以待检菌(及标准菌)不出现肉眼可见生长的最低药物浓度作为该抗菌药物对待检菌(及标准菌)的最低抑菌浓度(MIC)。为使结果判断快速清晰，