高效液相色谱法课件

返回章目录高效液相色谱法High

Performance

Liquid

Chromatography分析化学教研室高效液相色谱仪分析流程仿真系统1高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6小结习题及解答2返回章目录一、概述高效液相色谱法：以经典液相色谱为基础，在气相色谱的

理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。简称：HPLC；HRLC；SPLC；UPLC超高效液相色谱（Ultra

Performance

Liquid

Chromatography）与经典LC相比——高效高效填料：3～5μm高压泵输液高灵敏度的检测器:在线检测3返回章目录一、概述分析对象流动相差别GC能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%惰性气体HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，占有机物的80%液体，种类较多，选择余地广HPLC与GC区别4返回章目录一、概述HPLC仪器示意图5返回章目录一、概述Agilent

11006返回章目录一、概述HPLC仪器图SHIMADZUWATERSAGILENT7返回章目录一、概述application8返回章目录高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪69返回章目录二、基本原理范氏方程（Van

Deemter

equation)：重要GC：填充柱开口毛细管柱H

=

A

+

B/u

+CuH

=

B/u

+

CuHPLC：H

=

A

+

Cu原因：T↓；η↑；u↑→忽略B/u10返回章目录二、基本原理GC

和

HPLC

的

H-u

图(1)

B/u

(2)

Cu

(3)

A

(4)

HPLC的uopt(5)

GC的uopt11返回章目录二、基本原理HPLC：范氏方程（van

Deemterequation)H

=

A

+

CuA

=

2λdpC=

Cm+Csm影响因素：λ↓选球形固定相，高压、匀浆装柱法dp↓选粒径小的化学键合相C↓选粘度小、低流速的流动相12返回章目录高效液相色谱法概述1基本原理23各类高效液相色谱法固定相4流动相5高效液相色谱仪613返回章目录三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法（LSC）1液液分配色谱法（LLC）2化学键合相色谱法（BPC）314返回章目录三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法分离机理:组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面活性中心固定相:硅胶流动相:底剂（烷烃）+ 极性调节剂出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱例如：TLC15返回章目录三、各类高效液相色谱法液液分配色谱法分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异分类:概念及保留行为（重要）正相色谱

NPLC固定液极性>流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱反相色谱

RPLC固定液极性<流动相极性极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱16返回章目录三、各类高效液相色谱法化学键合相色谱法(bonded

phase

chromatography，BPC)概念：固定液的官能团通过化学反应键合在载体表面反相键合相离子抑制正相键合相17返回章目录离子对三、各类高效液相色谱法反相键合相色谱法(RBPC)分离机制：疏溶剂理论等固定相：非极性的键合相如:十八烷基硅烷键合相（ODS；C18柱)流动相：极性大的流动相如:甲醇-水或乙腈-水流动相极性与k的关系:极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑极性大的组分先出柱应用：非极性--中等极性组分(80%)18返回章目录三、各类高效液相色谱法正相键合相色谱法(NBPC)分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用力的差别固定相：极性大的氰基或氨基键合相流动相：极性小的底剂（烷烃）+极性调节剂流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓结构相近组分，极性大的组分后出柱19返回章目录三、各类高效液相色谱法离子对色谱法(IPC,PIC)分离机制：在流动相中加入离子对试剂，使形成不带电的中性离子对，以改善分离机理：流动相B+H+固定相BH++RSO-3+Na+RSO3Na[BH+.RSO-3]中性离子对[BH+.RSO-3]↗增加了在非极性固定相中溶解度。20返回章目录三、各类高效液相色谱法常用离子对试剂：分析对象离子对试剂例如碱烷基磺酸钠C5、C6、C7、C8磺酸钠,SDS酸四丁基季铵盐四丁基胺磷酸盐（TBA）21返回章目录三、各类高效液相色谱法离子抑制色谱法(ISC)分离机制：通过调节流动相的pH，抑制组分离解，

增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸，弱碱的目的适用范围：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸7.0≤pKa≤8.0

的弱碱抑制剂:弱酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液22返回章目录HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪623返回章目录四、固定相液-固色谱固定相载体：硅胶无定形全多孔硅胶球形全多孔硅胶YWG

YQG高分子多孔微球

YSG特点：柱选择性好，峰形好，柱效低24返回章目录四、固定相化学键合相 特点：不易流失；热稳定性好；化学性能稳定载样量大；适于梯度洗脱分类：非极性键合相：ODS中等极性键合相：醚基键合相极性键合相：氨基、氯基键合相25返回章目录四、固定相非极性键合相：ODS载体：全多孔YWG，YQG、堆积硅球表面覆盖度：§参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。§其大小，决定键合相是分配还是吸附占主导作用。键合基团键长：键长↑，载样量↑，k↑26返回章目录HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相45流动相高效液相色谱仪627返回章目录五、流动相要求：与固定液不反应；对样品有良好溶解度粘度小；与检测器匹配α

与固定相性质和流动相种类有关k

与流动相配比有关28返回章目录五、流动相正相洗脱反相洗脱流动相的极性小于固定相的洗脱流动相的极性大于固定相的洗脱洗脱方式：等度洗脱(isocratic

elution)恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱(gradient

elution)在一个分析周期内不断改变流动相的比例29返回章目录五、流动相30返回章目录HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪631返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵进样器色谱柱检测器工作站高效液相色谱仪HPLC32返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站泵： 恒压泵恒流泵:柱塞往复泵33返回章目录六、高效液相色谱仪Agilent

二元泵示意图34返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站35返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站色谱柱：由柱管(不锈钢管)和固定相组成分析柱φ

2-4.6mmφ

1-1.5mmφ

20-50mmL

10-25cm

常量柱

L

10-20cm

常微量柱L

3-25cm制备柱36返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站检测器:紫外检测器荧光检测器蒸发光散射检测器其它检测器37返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站38返回章目录六、高效液相色谱仪T/min波长(nm)色谱－光谱图39返回章目录六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站2489UVD2414RID2424ELSD2465ECDWATERSWATERS40返回章目录六、高效液相色谱仪超高效液相色谱仪(waters)41返回章目录小结熟悉掌握了解HPLC的特点.HPLC的仪器结构及各部件.HPLC中色谱条件的选择.化学键合相色谱法.范氏方程在

HPLC的表达形式.分离度影响因素正相色谱和反相色谱.42返回章目录习题及解答填空题：反相色谱中固定相的极性

小于

流动相的极性.HPLC中范氏方程的表达式为:

H

=

A

+

Cu

HPLC流动相的pH值应控制为

2-8

43返回章目录习题及解答A.极性减少

C.载样量增大B.极性增大

D.载样量减少选择题：1. 键合相的键合基团的碳链长度增长后

(

AC

)2. 提高色谱柱柱效的可行方法是

(B.降低固定相的粒度分布

D.匀浆装柱F.选择适宜流动相A.选择小粒度的固定相

C.选择球形固定相E.增加柱长

G.降低流速ABCD)44返回章目录习题及解答计算题：1.

用15cm长的ODS柱分离两个组分，