分子生物学实验技术课件

分子生物学实验技术一、基因克隆技术目的基因和载体限制性内切酶酶切DNA连接酶连接转化抗性筛选获得基因序列：通过RT-PCR或基因组数据库获得引物设计及PCR扩增目的片段PCR产物连接到载体上构建成重组载体重组载体转化到大肠杆菌中进行质粒扩增或表达蛋白抗性筛选基因克隆实验的一般过程质粒转化大肠杆菌的过程

感受态非定向克隆+或克隆的片段只能按特定方向连接定向克隆+基因组DNA文库的构建基因组DNA文库的类型质粒文库（﹤10kb)噬菌体文库（0-23kb)黏粒文库(~45kb)酵母人工染色体文库(又称大片段基因组DNA文库，100kb—1Mb）基因组DNA文库的构建流程插cDNA文库的构建基因组DNA文库与cDNA文库的比较（三）PCR衍生技术PCR过程反转录PCR实时荧光定量PCR

PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为

CT

值（thresholdvalue）。

荧光定量PCR化学原理

非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲线分析

2、TaqMan探针法

TaqMan作用机理

原位PCR技术原理由于细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进PCR扩增时，各种成分（如如引物、DNA聚合酶、核苷酸等）均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，与原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大、或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数级扩增，扩增的产物就可以被原位杂交技术检测出来。

重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构建重叠延伸PCR原理二、基因组学研究标记性示踪物——放射性和非放射性基因活性和功能研究：基因表达系列分析，DNA微阵列和微芯片，体内带白纸积累的检测，基因敲除，RNA干涉

三、DNA-蛋白互作技术过滤结合染色质免疫沉淀法凝胶阻滞分析DNA酶足迹DNase足迹法，DMS足迹法酵母单杂交将已知顺式作用元件构建到最基本启动的上游，把报告基因连接到启动子下游，将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能与顺式作用元件结合，就能激活启动子使报告基因得到表达。酵母双杂交真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的，即DNA结合域（BD)和转录激活域（AD)单独的BD与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能形式激活转录的功能。凝胶阻滞在凝胶电泳中，如果DNA与某种蛋白质相结合，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在电泳中移动的距离变小，表现为相对滞后。DNaseI足迹蛋白质与DNA特定区段相结合，从而使该区段DNA免受DNase的降解，在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记条带。染色质免疫共沉淀（ChiP）在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。四、蛋白组学研究蛋白质分离蛋白质分析蛋白质相互作用的研究方法：酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表面等离子共振技术，荧光共振能量转移技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共沉淀技术，pull-down技术蛋白质分离最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质分析蛋白质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。两种离子发生方法：基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化（ESI)噬菌体展示技术噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一种技术。将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的噬菌体展示库。将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进行质谱鉴定。表面等离子共振技术（SPR）SPR是利用单色偏振光与金属膜内表面店子发生的等离子共振时，SPR角（反射光强度最小时的入射角）与金属表面结合的生物分子的质量呈正比，如将“诱饵”蛋白座位配基，固化在几十纳米的金属膜表面，加入“猎物”蛋白溶液，这样就可以通过SPR角的改变来反映“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白形成的蛋白质复合物从而反映二者的相互作用。荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。

作为规模化功能蛋白质组学研究的手段的蛋白质芯片技术，是DNA芯片技术的扩展，即在固体支持物表面高密度地固定化排列探针蛋白点阵，以特异地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。Proteinmicroarray（蛋白质芯片）免疫共沉淀技术当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质与蛋白质的相互作用被保留下来，如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉淀复合物被分开，然后用免疫印记或质谱检测目的蛋白。