微生物的遗传变异和育种7课件

第七章微生物的遗传变异和育种遗传和变异是生物体最本质的属性之一。在遗传性适宜的环境条件下时，通过代谢和发育才能使其后代转化为与亲代相同的具体性状。对微生物遗传变异规律的深入研究，不仅促进了现代生物学的发展，而且还为微生物育种工作提供了丰富的理论基础。第一节微生物的遗传与变异概述遗传性：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。表型：指某一生物个体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体表现。变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。变化后的新性状是稳定的、可遗传的。饰变：指外表的修饰性改变，即一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。饰变是不遗传的。例如，粘质沙雷氏菌，在25℃下培养时，会产生一种深红色的灵杆菌素，把菌落染成似鲜血那样。可是，当培养在37℃下时，群体中所有细胞都不产色素。如果重新降温至25℃，产色素能力又得到恢复。只有遗传型的改变，即生物体遗传物质结构上发生的变化，才称为变异。第二节遗传变异的物质基础（一）、核酸－－遗传变异的物质基础（3个经典实验）1、经典转化实验Griffith是第一个发现转化现象的，虽然当时还不知道称之为转化因子的本质是什么，但是他的工作为后来Avery等人进一步揭示转化因子的实质，确立DNA为遗传物质奠定了重要基础。2、噬菌体感染实验1952年，Hershey和Chase证实了DNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验。T2噬菌体的实验3、植物病毒重建实验

1956年Fraenkel-Conrat等用含RNA的烟草花叶病毒进行了病毒重建实验，证实了RNA是遗传物质。(1)用表面活性剂处理标准TMV，得到它的蛋白质；(2)从TMV的变种HR通过弱碱处理得到它的RNA；(3)通过重建获得杂种病毒；(4)证实杂种病毒的蛋白质外壳是来自TMV标准株。(5)杂种病毒感染烟草产生HR所特有的病斑，说明杂种病毒的感染特性是由HR的RNA所决定，而不是二者的融合特征(6)从病斑中一再分离得到的子病毒的蛋白质外壳是HR蛋白质，而不是标准株的蛋白质外壳。以上实验结果说明杂种病毒的感染特征和蛋白质的特性是由它的RNA所决定，而不是由蛋白质所决定，遗传物质是RNA。（二）、核酸的结构与复制1、DNA的结构（A、T、C、G）2、RNA的结构（A、U、C、G）3、核酸的复制－－半保留复制真核微生物的核内DNA与组蛋白结合成为染色体。原核微生物的DNA不与蛋白质结合，呈松散的核质体状态存在。（三）、遗传物质在细胞内存在的方式遗传性变异是由基因结构发生改变所致，主要通过基因突变、基因损伤后的修复、基因的转移与重组来实现。第三节基因突变和诱变育种

基因突变

又称点突变，DNA链上的一对突变或少数几对碱基发生改变。(碱基置换、移码突变)

染色体畸变DNA的大段变化(损伤)现象(添加、缺失、易位、倒位)

基因重组：把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组(原核生物、真核生物)遗传性变异（一）基因突变的类型

1、营养缺陷型2、抗性突变型3、条件致死突变型4、形态突变型5、抗原突变型6、其他突变型如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和产量以及对某种药物的依赖性突变型等。一、基因突变（二）基因突变的特点(7个特点)

1不对应性2自发性3稀有性4独立性5诱变性6稳定性7可逆性1、不对应性

即突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。例如，细菌在有青霉素的环境下，出现了抗青霉素的突变体；在紫外线的作用下，出现了抗紫外线的突变体；在较高的培养温度下，出现了耐高温的突变体等。表面上看来，会认为正是由于青霉素、紫外线或高温的"诱变"，才产生了相对应的突变性状。事实恰恰相反，这类性状都可通过自发的或其任何诱变因子诱发而行。这里的青霉素、紫外线或高仅是起着淘汰原有非突变型(敏感型)个体的作用。2、自发性

各种性状的突变，可以在没有人为的诱变因素处理下自发地发生。"自发突变"决不意味着这种突变是没有原因的，而只是说明人们对它们还没有很好认识而已。3、稀有性

自发突变虽可随时发生，但突变的频率是较低和稳定的，一般在10-6~10-9间。所谓突变率，一般指每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的机率。例如，突变率为1×10-8者，就意味着当108个细胞群体分裂成2×108个细胞时，平均会形成一个突变体。4、独立性

突变的发生一般是独立的，即在某一群体中，既可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素或任何其他药物的抗药性，而且还可发生其他不属抗药性的任何突变。某一基因的突变，既不提高也不降低其他基因的突变率。5、诱变性

通过诱变剂的作用，可提高自发突变的频率，一般可提高10-105倍。不论是自发突变或诱发突变(诱变)得到的突变型，它们之间并无本质上的差别，因为诱变剂仅起着提高突变率的作用。6、稳定性

由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定的变化，所以产生的新性状也是稳定的、可遗传的。7、可逆性

由原始的野生型基因变异为突变型基因的过程，称为正向突变，相反的过程则称为回复突变或回变。实验证明，任何性状既有正向突变，也可发生回复突变。（三）基因突变自发性和不对应性的实验证明1、Luria等的变量试验（彷徨实验）2、Newcombe的涂布试验3、Lederberg等的影印平板培养法彷徨试验(fluctuationtest)影印试验(replicaplating)

1、物理诱变：紫外线、X射线等紫外线诱变机制辐射剂量光复活作用二、诱变与育种

2、化学诱变：

诱变剂：

亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝基胍等

诱变机制注意事项：

选择适宜的诱变剂及剂量，适当的温度和PH，终止反应，安全基因突变及其机制(一)自发突变与育种1、从生产实践中选育

选育步骤(1)采样(2)加富培养(3)平板分离(4)性能测定三、突变与育种

定向培育一般是指用某一特定环境长期处理某一微生物培养物(群体)，同时不断对它们进行移种传代，以达到积累和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。由于自发突变的频率较低，变异程度较轻微，所以培育新种的过程一般十分缓慢。与诱变育种、杂交育种和基因工程技术相比，定向培育法带有守株待兔的被动状态。例如，异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物(即结构类似物)，两者分子结构类似。

2、定向培育优良菌种(二)诱变育种

诱变育种就是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后设法采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的突变株，以供生产实践或科学实验之用。诱变育种除提高产量外，还可改进产品质量、扩大品种和简化工艺等目的。它具有方法简便、工作速度快和收效显著等优点，仍是目前最广泛使用的育种手段。1、诱变育种的基本环节1、初筛：以量为主2、复筛：以质为主2、诱变育种的步骤

3、营养缺陷型的筛选营养缺陷型(auxotroph)是指通过诱变而产生的，在一些营养物质(如氨基酸、维生至少和碱基等)的合成能力上出现缺陷，因此必须在基本培养基(minimalmedium)中加入相应的有机营养成分才能正常生长的变异菌株。野生型是指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。在其相应的基本培养基上生长。基本培养基完全培养基补充培养基与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基：筛选营养缺陷型菌株4个环节：

(1)诱变剂处理(2)淘汰野生型(3)检出缺陷型(4)鉴定缺陷型4、诱变育种工作中的几个原则

(1)选择简便有效的诱变剂目前在实践上常用的诱变剂主要有紫外线(u.v.)、氮芥、硫酸二乙酯、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG或MNNG)和亚硝基甲脲(NMU)等。后两种因为有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。

(2)挑选优良的出发菌株

(4)选用最适剂量要确定一个合适的剂量，常常要经过多次试验。就一般微生物而言，诱变率往往随剂量的增高而提高，但达到一定剂量后，再提高剂量反而会使诱率下降。根据对紫外线、X射线和乙烯亚胺等诱变效应的研究结果，发现正变转多地出现在偏低的剂量中，而负变较多地出现于偏高的剂量中；还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。因此，在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的剂量。

(5)利用复合处理的协同效应诱变剂的复合处理常常呈现一定的协同效应，这对育种实践是很有参考价值的。

(6)利用和创造形态、生理与产量间的相关指标为了确切地了解某一突变株产量性状的提高程度，必须进行大量的分析测定和统计工作。(7)设计和采用高效筛选方案和方法通过诱变处理，在微生物群体中会出现种种突变型个体，绝大多数是负变体，要在其中把极个别的产量提高较显著的正变体筛选到手，就要求采用效率较高的科学筛选方案和方法。

筛选过程以分初筛与复筛两阶段进行为好。前者以量(选留菌株的数量)为主，后者以质(测定数据的精确度)为主。第四节基因重组

凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组。重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。

重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交。真核微生物中的有性杂交、准性杂交及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。基因重组是杂交育种的理论基础。由于杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为亲本，因此不论在方向性还是自觉性方面，都比诱变育种前进了一大步。(一)接合

通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程，称为接合(有时也称"杂交")。一、原核微生物的基因重组接合：是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。能通过结合方式转移的质粒称为接合性质粒，不能通过性菌毛在细菌间转移的质粒为非接合性质粒。受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象，称转化。(二)转化(三)转导

通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得了前者部分遗传性状的现象，称为转导。

根据转导基因片段的范围，可将转导分为两类：普遍性转导（转导的DNA可是供菌染色体上的任何部分）、局限性转导（转导的DNA只限供菌染色体上的特定基因）。普遍性转导(generalizedtransduction)(四)原生质体融合

通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，称为原生质体融合或细胞融合。原生质体融合的一般原理和主要过程先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶(如细菌可用溶菌酶或青霉素处理，入线菌可用溶菌酶或相应的脱壁权衡利弊，真菌可用蜗牛酶或相应的脱壁酶等)去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子（一）有性杂交（二）准性杂交菌丝联结异核体的形成形成双倍体分离子的产生二、真核微生物的杂交育种目的基因（即外源基因或供体基因）的取得载体系统的选择，目的基因与载体重组体的构建，