在基因水平诊断疾病课件

在基因水平诊断疾病第一节基因诊断的概念及常用技术

患者临床表现：中医的望闻问切与西医的影像学检查细胞形态、生化检测及免疫学检验：生命活动的结构和物质基础

ConceptofGeneDiagnosis第一节基因诊断的概念及常用技术基因诊断的概念基因诊断的出现：1976年加州大学华裔科学家KanYW用核酸分子杂交首次对一例α珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断

狭义:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾病作出诊断。Voguereferences：forensicmedicine,identificationofbiologicalspecies,etc.

基因诊断的概念第一节基因诊断的概念及常用技术基因诊断的概念与传统诊断的区别：直接以病理基因（致病基因、疾病相关基因和外源性病原生物基因等）为分析对象，即对待诊生物材料某一（些）特定基因进行分析判断。第一节基因诊断的概念及常用技术第一节基因诊断的概念及常用技术

ConceptofGeneDiagnosisEssentialbasisofgenediagnosis遗传物质改变：一是DNA或RNA水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高等；二是基因结构变化即突变，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活等。

Essentialbasisofgenediagnosis疾病或个体表型的本质生物遗传学基本规律分子生物学技术与方法第一节基因诊断的概念及常用技术

ConceptofGeneDiagnosisHybridizationandPCRarebasictechniquesusedingenediagnosis（一）应用核酸分子杂交可进行基因的特异识别和分析核酸杂交的基本原理：DenaturevsAnneal(Renature)第一节基因诊断的概念及常用技术核酸变性和复性理论：（1）双链DNA分子在某些理化因素作用下解旋，条件恢复后又可恢复其双螺旋结构；（2）具有互补碱基序列的异源核酸单链之间同样可按碱基互补配对原则通过氢键结合为双链。

核酸分子杂交和PCR扩增是基因诊断的基本技术

核酸杂交的基本过程：PreparationofSamplesandProbesPrehybridizationandHybridizationDetectionandAnalysisoftheResult第一节基因诊断的概念及常用技术核酸分子杂交和PCR扩增是基因诊断的基本技术1.制备合适的探针是核酸杂交用于基因诊断的关键Whatisaprobe?标记的已知序列核酸片段，包括DNA,cDNA,RNA,Oligonucleotide第一节基因诊断的概念及常用技术针对具体情况选择合适的探针序列是基因诊断准确、特异、简便、可靠的基础。第一节基因诊断的概念及常用技术核酸分子杂交和PCR扩增是基因诊断的基本技术2.不同形式的核酸分子杂交可用于不同的诊断目的

Southernblot

Northernblot

dothybridization

reversedothybridizationFISH:fluorescenceinsituhybridization2.不同形式的核酸分子杂交可用于不同的诊断目的

Southernblot一般过程：提取DNA→限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离（DNA分子有其独特的限制性酶切图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带）→变性处理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→预杂交及杂交→结果检测与分析HybridizationandPCRarebasictechniquesusedingenediagnosis（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术

PrincipleofPolymeraseChainReaction第一节基因诊断的概念及常用技术PCR原理示意图

PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段合成的过程（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术

N=N0(1+E）nN-扩增产物的量;N0-起始靶DNA分子数E-扩增效率；n-循环次数。理论上，从一个模板分子起始，经过n次聚合反应后可合成2n个分子。如进行30轮扩增，则可合成出230，即109个待检分子；对一段500bp的DNA片段来说，约等于1μg。pgμg3.病毒性肺炎如冠状病毒、腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等。4.真菌性肺炎如白念珠菌、曲霉、放射菌等。5.其它病原体所致的肺炎如立克次体、弓形虫、原虫、寄生虫如肺包虫、肺吸虫、肺血吸虫）等。机体免疫力低下者（如艾滋病患者）容易伴发肺部卡氏肺包子虫、军团菌、鸟形分支杆菌、结核菌、弓形体等感染。6.理化因素所致的肺炎如放射性肺炎、胃酸吸入、药物等引起的化学性肺炎等。7.支原体肺炎由肺炎支气体引起。编辑本段发病原因

肺炎患肺炎的原因可能是：接触到一些厉害的病菌或病毒身体抵抗力弱，如长期吸烟。上呼吸道感染时，没有正确处理。例如是没有正确地看医生、没有正确地看服药，又或者是滥用止咳药止咳以至痰和菌愈积愈多（Sputumretention)。如果一年内有多过一次真正的肺炎（一些医生误看X光片或滥用了肺炎的诊断)，原因可能是：身体抵抗力弱（先天性或后天性)气管有异物。尤其是幼童。心肺有其它病变：如癌病、气管扩张、肺尘埃沉着病、没有正确地看医生、没有正确地看服药，又或者是滥用止咳药止咳以至痰和菌愈积愈多（Sputumretention)工作环境有问题。注意改善空气流通、冷气系统。

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PCR在基因诊断中的作用

从极少样品即可扩增出肉眼可见的产物。放大待诊信号，提高检测灵敏度

（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术

PCR及其衍生技术直接运用PCR扩增：异常缺失与存在PCR产物的限制性酶谱分析（PCR-RE)和限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP)RFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphism

（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术

PCR及其衍生技术PCR－RFLP：通过PCR将包含待测位点的DNA片段扩增后，用识别相应位点的限制性核酸内切酶水解，根据所产生限制性片段的数量和长度作出诊断。用于已知突变位点的验证性诊断

（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术

PCR及其衍生技术3.PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-ASO，PCR-DB)

ASO:AlleleSpecificOligonucleotide1).wildprobevsmutantprobe2).已知突变的验证性检测3).可区分纯合子和杂合子

（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术

PCR及其衍生技术4.PCR产物的反向点杂交分析（PCR-RDB）

RDB:ReverseDotBlot固定探针

（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术PCR及其衍生技术5.PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP)

将PCR产物变性为单链后进行非变性（中性）聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变即可造成DNA单链构象的改变，进而导致电泳速率变化，从而检测出基因突变。1）单链核酸碱基-构象-电泳速率2）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR-SSCP分析原理示意（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术PCR及其衍生技术

6.PCR-变性梯度凝胶电泳分析（PCR-DGGE）DenaturingGradientGelElectrophoresis（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术PCR及其衍生技术7.甲基化特异性PCRMethylationspecificPCR,MS-PCR模板甲基化处理：Na2SO3C-U需设计特异性甲基化引物G:C/A:U3’GGACGTAGA5’非甲基化引物5’---CCTGCATCT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------CGCGATCCG---5’5’GCGCATGGC3’3’AAACATAAA5’甲基化引物5’---UUTGUATUT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------AUGUGATUU---5’5’TACACATAA3’3’GGACGTAGA5’5’---CCTGCmATCT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------CGCGATCmCmG---5’5’GCGCATGGC3’3’AAACATAAA5’5’---UUTGCmATUT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------UGUGATCmCmG--5’5’ACACATAAC3’若存在甲基化位点

（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术PCR及其衍生技术8.靶核酸的定量分析Q-PCR,QuantitativePCR基本原理：PCR指数扩增规律N=N0(1+E）n

PCR扩增有限性-平台期及平台效应（plateaueffect）PCR扩增的平台效应PCR及其衍生技术8.靶核酸的定量分析（1）测定PCR产物量：

梯度（系列）稀释法：先对已知量的靶DNA进行梯度稀释（类似于比色）灰度扫描法

（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术例：PCR产物定量PCR及其衍生技术8.靶核酸的定量分析（2）极限稀释法基本依据：PCR扩增的有效起始模板分子数为104～106个

（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术PCR及其衍生技术8.靶核酸的定量分析（3）非竞争性对照法基本依据：同时扩增靶序列和内标序列（扩增效率相似）如看家基因（housekeeper)用于RT-PCR进行表达分析

（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术PCR及其衍生技术8.靶核酸的定量分析（4）竞争抑制法需制备标准参照核酸

（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术PCR及其衍生技术8.靶核酸的定量分析（5）荧光标记探针法分析：安全、简便快捷、多重检测

荧光定量PCR实时(realtime)PCRHybridizationandPCRarebasictechniquesusedingenediagnosis（三）DNA序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术第一节基因诊断的概念及常用技术例：四色荧光自动测序分析结果病例SOX9基因HMGbox内发生单碱基置换突变R178L(G→T)，如图2所示，左侧正常对照第225位碱基为C，而该患儿为A（反义链中）

例：序列分析用于基因诊断研究HybridizationandPCRarebasictechniquesusedingenediagnosis（四）DNA芯片技术是应用前景广阔的基因诊断技术（DNAchips)第一节基因诊断的概念及常用技术生物芯片（biochip&bioarray)技术：根据生物分子间特异性相互作用，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质等各种生物成分的高通量快速检测分析。疾病诊断芯片个性化用药芯片例：基因芯片杂交结果二.基因诊断有其独特的优点第一节基因诊断的概念及常用技术高特异性：诊断目标高灵敏度：分子生物学方法结果稳定可靠：核酸的化学本质早期诊断性：分子遗传学规律应用广泛性：疾病与非疾病检查第二节基因诊断策略在分子发病机制水平上对不同疾病的区分诊断策略各不相同第二节基因诊断策略不同的基因诊断策略致病基因检测连锁遗传标志检测基因表达定量分析表型相关的系列基因克隆

CommonlyusedTechniquesSouthern印迹杂交限制性酶谱分析限制性片段长度多态性分析寡核苷酸探针杂交PCR及其衍生技术DNA芯片技术第三节基因诊断的应用前景第三节基因诊断的应用前景1.杂交基础上的RFLP分析2.PCR及其衍生技术3.芯片阵列杂交基因诊断的发展历史第三节基因诊断的应用前景1.理论2.技术3.伦理基因诊断的问题第三节基因诊断的应用前景However,genediagnosisispromisingindevelopment基因诊断技术途径：①直接分析致病基因分子结构及表达是否异常的直接诊断途径；②利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析的间接诊断途径。第四节遗传病的基因诊断第四节遗传病的基因诊断直接诊断：检测已知致病基因必要条件①被检基因的突变类型与疾病发病有直接的因果关系：②被检基因的正常分子结构已被确定；③被检基因突变位点固定而且已知。1.点突变：（1）导致特异性限制性内切酶位点改变

直接诊断：检测已知致病基因镰状红细胞贫血HBS-Beta株蛋白基因突变：

PCR-RE分析MstIICCTGAGG-CCTGTGGBeta株蛋白生成障碍性贫血-Beta株蛋白基因突变：PCR-RE分析MaeICAAG-CTAG1.点突变：（2）无限制性酶切位点改变直接诊断：检测已知致病基因PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交及等位基因特异PCR（allelespecificPCR，AS-PCR）或称为等位基因特异性扩增（ASA）等技术。PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交技术可快速、简易地检测已知突变。

反向点杂交示意：直接诊断：检测已知致病基因在DNA序列上有较长一段序列的重新排布。包括大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变进而引起更大范围内的染色体结构上的改变从而影响多个基因的功能，即染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等2.基因重排：核酸分子探针杂交与PCR

（1）Southern印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号（2）多重PCR，1988年Chamberlain等采用多重PCR技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养不良蛋白基因的多个基因座

直接诊断：检测已知致病基因3.基因表达异常mRNA的相对定量分析mRNA的绝对定量分析

mRNA长度分析直接诊断：检测已知致病基因

Reversetranscription-PCR(RT-PCR)原理实时荧光定量RT-PCR（1）3.病毒性肺炎如冠状病毒、腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等。多种肺炎细菌均可引起大叶性肺炎，但绝大多数为肺炎链球菌，其中以Ⅲ型致病力最强。肺炎链球菌为革兰阳性球菌，有荚膜，其致病力是由于高分子多糖体的荚膜对组织的侵袭作用。少数为肺炎杆菌、金黄*色葡萄球菌、溶血性链球菌、流感嗜血杆菌等。肺炎链球菌为口腔及鼻咽部的正常寄生菌群，若呼吸道的排菌自净功能及机体的抵抗力正常时，不引发肺炎。当机体受寒、过度疲劳、醉酒、感冒、糖尿病、免疫功能低下等使呼吸道防御功能被削弱，细菌侵入肺泡通过变态反应使肺泡壁毛细血管通透性增强，浆液及纤维素渗出，富含蛋白的渗出物中细菌迅速繁殖，并通过肺泡间孔或呼吸细支气管向邻近肺组织蔓延，波及一个肺段或整个肺叶。大叶间的蔓延系带菌的渗出液经叶支气管播散所致。编辑本段临床表现多数起病急骤，常有受凉淋雨、劳累、病毒感染等诱因，约1/3患病前有上呼吸道感染。病程7~10天。（一）寒战、高热：典型病例以突然寒战起病，继之高热，体温可高达39℃~40℃，呈稽留热型，常伴有头痛、全身肌肉酸痛，食量减少。抗生素使用后热型可不典型，年老体弱者可仅有低热或不发热。（二）咳嗽、咳痰：初期为刺激性干咳，继而咳出白色粘液痰或带血丝痰，经1~2天后，可咳出粘液血性痰或铁锈色痰，也可呈脓性痰，进入消散期痰量增多，痰黄而稀薄。（三）胸痛：多有剧烈侧胸痛，常呈针刺样，随咳嗽或深呼吸而加剧，可放射至肩或腹部。如为下叶肺炎可刺激隔胸膜引起剧烈腹痛，易被误诊为急腹症。（四）呼吸困难：由于肺实变通气不足、胸痛以及毒血症而引起呼吸困难、呼吸快而浅。病情严重时影响气体交换，使动脉血氧饱和度下降而出现紫绀。打造最权威的专业课件本文档免费浏览阅读，下载后可以编辑修改。医学精品课件实时荧光定量RT-PCR（2）间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标志DNA多态性：指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上DNA核苷酸序列存在一定的差异或变异。第四节遗传病的基因诊断多态性在人群中出现的频率应大于1%（如小于1%常认为是异常突变）。在生物进化过程中形成的，它本身并不致病或于遗传病有直接联系，故称为“中性突变”。人类的23对染色体中，每一条上都带有许多遗传多态性位点，其中一些位点在染色体上的位置与致病基因靠的很近，甚至连锁在一起遗传，并且呈孟德尔式遗传。因此，可利用这一多态性位点作为遗传指示标记。

第四节遗传病的基因诊断间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标志三代遗传标志：1.RFLP2.STR(shorttandemrepeats),VNTR(variablenumberoftandemrepeats)3.SNP(singlenucleotidepolymorphism)

间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标志镰状红细胞贫血HBSDNA指纹分析用于个体鉴定

人为什么长肿瘤物种的进化建立在基因突变的基础之上，但是这必然也可能带来副产品：人类恶性肿瘤的生长。这是人类进化必然要付出的代价。

我们要想根绝肿瘤，是不可能的。肿瘤发生是生物衰老在基因水平的机理之一，自然界不可能让一个生物长生不死，生生不息。人的免疫功能减退，出现肿瘤，然后死亡，这是自然界宏观的平衡调控机制起作用的结果，包含进化方面的积极意义，这就是为什么自然界要让人类长肿瘤的原因。

群言堂第五节肿瘤的基因诊断当前的一个误区是对肿瘤过于偏激，闻癌色变，片面地把它当作深恶痛绝的东西，导致治疗上的误区：想尽办法去杀死它。利用放、化疗技术杀死肿瘤细胞，结果把体内很多良性细胞也杀死了。把80岁前病故的人都做一遍尸解，就会发现100%的人体内都有肿瘤；人如果活到120岁，体内会有3到4个恶性肿瘤，但不影响生活质量。许多人不知道自己患有肿瘤，所以没有精神恐惧和巨大的压力。

第五节肿瘤的基因诊断70、80岁以后长肿瘤，属生理现象，很正常；70岁以前长肿瘤则是是病理性的

肿瘤的危险主要在于发现得太晚，一旦发现就难以治愈，这样给人们造成了极大的