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生物化学实验上饶师范学院生物科学实验教学中心目录1.生物化学实验室规那么2.生物化学实验根本操作3.实验一3,5——二硝基水杨酸比色定糖法4.实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳5.实验三总氮量的测定——微量凯氏〔Micro-Kjeldahl〕定氮法上饶师范学院生物科学实验教学中心

6.实验四脂肪碘值的测定7.实验五维生素C的定量测定8.实验六小麦萌生前后淀粉酶活力的比较9.实验七组织DNA的提取纯化10.实验八酪蛋白的制备上饶师范学院生物科学实验教学中心生物化学实验室规那么〔2课时〕1每个同窗都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂次序，不迟到，不早退，不大声谈笑。2实验前必需仔细预习，熟习本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的运用方法，否那么不能开场实验。3实验过程中要听从教员的指点，严肃仔细地按操作规程进展实验，并把实验结果和数据及时、照实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。完成实验后经教师检查签字赞同，方可分开实验实。上饶师范学院生物科学实验教学中心

4实验台面应随时坚持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用毕，应立刻盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验终了，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才干分开实验室。5运用仪器、药品、试剂和各种物品必需留意节约。洗涤和运用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。运用贵重精细仪器时，应严厉遵守操作规程，发现缺点须立刻报告教师，不得擅自动手检修。上饶师范学院生物科学实验教学中心

6实验室内严禁吸烟！留意水电平安，分开实验室前，必需关好水龙头，拉下电闸，严防发惹事故！7废液倒入专门的废液桶，固体废物和带残渣的废物不得倒入水槽或四处乱扔。8仪器损坏时，应照实向教师报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。上饶师范学院生物科学实验教学中心

9实验室内一切物品，未经本室担任教师同意，严禁携出室外，借物必需办理登记手续。10每次实验课由班长担任安排值日生。值日生的职责是担任当天实验室的平安、卫生和一切效力性的任务。上饶师范学院生物科学实验教学中心生物化学实验根本操作〔2课时〕一.玻璃仪器的洗涤在生化实验中，玻璃仪器干净与否，是获得准确结果的重要环节。干净的玻璃仪器内壁应十清楚亮光洁，无水珠附着在玻壁上。㈠常用的洗涤方法：1.普通仪器，如烧杯、试管等可用毛刷蘸肥皂液、合成洗涤剂仔细刷洗。然后用自来水反复冲洗，最后用少量蒸馏水冲洗2~3次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干备用。上饶师范学院生物科学实验教学中心

2.容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。用后应及时用自来水多次冲洗，细心检查干净程度，根据挂不挂水珠采取不同处置方法。〔1〕如不挂水珠，用蒸馏水冲洗、枯燥，方法同上；〔2〕如挂水珠，那么应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡4~6小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后枯燥。上饶师范学院生物科学实验教学中心

3.粘附有血浆的刻度吸量管等，有三种洗涤方法：〔1〕先用45%尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，然后用自来水冲洗；〔2〕也可用1%氨水浸泡，使血浆溶解，然后再依次用1%稀盐酸溶液、自来水冲洗；〔3〕以上二法如达不到清洁要求，可浸泡于重铬酸钾洗液4~6小时，再用大量自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2~3次。上饶师范学院生物科学实验教学中心

4.新购置的玻璃仪器，应先置于1~2%稀盐酸溶液中浸泡2~6小时，除去附着的游离碱，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2~3次。5.凡用过的玻璃仪器，均应立刻洗涤，久置干涸后洗涤非常困难。如不能及时洗涤，先用流水初步冲洗后浸泡在清水中，待后按常规处置。上饶师范学院生物科学实验教学中心

㈡运用重铬酸钾洗液〔以下简称洗液〕时应留意以下几点：1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前应尽量沥干。否那么会因洗液被稀释而降低洗液的氧化力。2.Hg2+、Ba2+、Pb2+等离子可与洗液发生化学反响，生成不溶性化合物堆积在容器壁上。因此，凡接触过上述离子的容器，应先除去上述离子〔可用稀硝酸或5~10%EDTA钠去除〕。3.油类、有机溶剂等有机化合物可使洗液复原失效。因此，容器壁上附有大量油类、有机物时，应先除去。上饶师范学院生物科学实验教学中心

4.洗液的酸性和氧化性很强，运用时应格外留意，千万不要滴落在皮肤或衣物上，以免灼伤或烧坏。5.洗液颜色由深棕色变为绿色时，阐明洗液曾经失效，应停顿运用，改换新液。因重铬酸变成硫酸铬后不再具有氧化性。上饶师范学院生物科学实验教学中心

重铬酸钾洗液的配制:取重铬酸钾20g溶于20ml蒸馏水中，加热至沸。冷却后再将200ml浓硫酸渐渐参与，边加边搅拌。留意：此时可产生高热。为防止容器破裂，应选用耐酸搪瓷缸或耐高温的玻璃器皿，切忌用量筒及试剂瓶等配制。为防止洗液吸收空气中的水分而被稀释蜕变，洗液应储存于带盖的容器中。当清洁效能降低时，再参与少量重铬酸钾及浓硫酸就可继续运用。上饶师范学院生物科学实验教学中心

二.吸量管的运用吸量管和定量吸(移)液器(微量加样器)均为用来转移一定体积溶液的量器。㈠吸量管：生化实验中常用的有三种，最常用的是刻度吸量管。1.刻度吸量管：⑴刻度吸量管的种类：上饶师范学院生物科学实验教学中心

①按容量规格来分，有0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、5、10ml等数种。其精细度按不同的容积可达移取量的0.1~1%。通常将管身标明的总容量分刻为100等分。因此，10ml的吸量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表0.01ml,其他类推。上饶师范学院生物科学实验教学中心

②按“零〞点位置来分，有“O〞点在吸量管上端的〔即读数从上而下逐渐增大〕，也有“O〞点在吸量管下端的〔读数从下而上逐渐增大)。两种标示方法，在运用时各有方便之处。③按刻度方法来分，刻度吸量管也有两种，一种是刻度刻到尖端的，将液体放出时，应吹出残留在吸量管尖端的少量液体(我实验室的刻度吸量管全部是这一种)，另一种是刻度不刻到尖端的。上饶师范学院生物科学实验教学中心

⑵刻度吸量管的正确运用方法：用右手拇指和中指夹住管身，将吸量管的尖端伸入试液深处，左手持洗耳球把试液吸入管内至高过刻度以上时，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制试液的泄放。吸液后应尽量使吸量管坚持垂直，使右眼与刻度等高，略微轻抬食指或悄然转动吸量管，使试液面缓慢降落，至管内试液弯月面的最低点与吸量管的刻度线相齐为止。然后将吸量管插到需加试剂的容器中，让尖端与容器内壁靠紧，松开食指让液体流出。液体流完后再等15秒钟，捻动一下吸量管后移去〔如需吹的吸量管，那么吹出尖端的液体后再捻转一下吸量管移去〕。上饶师范学院生物科学实验教学中心

⑶运用刻度吸量管的本卷须知：①选择适当规格的吸量管：吸量管的最大容积应等于或略大于所需容积〔ml数〕。②仔细看清吸量管的刻度情况：刻度能否包括吸量管尖端的液体？读数方向是从上而下，还是从下而上？③拿吸量管时，刻度一定要面向本人，以便读数。上饶师范学院生物科学实验教学中心

④汲取试剂时应留意三点：一是先吹去吸量管内能够存在的残留液体，二是将吸量管插入试剂液面深部(以免吸液过程中因液面降低而吸入空气产生气泡或管内试剂进入洗耳球)，三是运用洗耳球(不可直接用口吸)。⑤按吸量管上口时应该用食指，不能用拇指。上饶师范学院生物科学实验教学中心

⑥汲取粘滞性大的液体(如血液、血浆、血清等)时，除选用适宜的吸管(奥氏管)外，应留意拭净管尖附着的液体，尽量减慢放液速度(用食指压力控制)，待液体流尽后吹出管尖残留的最后一滴液体。⑦运用的吸量管应干净、枯燥无水。如急用而又有水时，可用少量欲取试剂冲洗3次，以免试剂被稀释。上饶师范学院生物科学实验教学中心

2.移液吸量管：也有两种，常见的一种是吸量管的上端只需一个刻度，另一种是除了在吸量管上端有刻度外，在吸量管下端狭窄处也有一刻度线。无论哪一种，在运用时将量取的液体放出后，只需将吸量管的尖端触及受器壁约半分钟即可，不得吹出尖端的液体。3.奥氏吸量管：准确度最高，运用时必需吹出留在尖端的液体。上饶师范学院生物科学实验教学中心

㈡定量吸(移)液器(微量加样器)：定量吸液器是吸量管的革新产品。由塑料制成。目前，因产地厂家不同其质量、价钱差别非常悬殊。1.定量吸液器的优点：运用方便，取、加样迅速，计量准确，不易破损，能汲取多种样品〔只换吸嘴即可〕。上饶师范学院生物科学实验教学中心

2.定量吸液器的类型：有两种类型。⑴固定式：只能取加一定容量的试剂，不能随意调理取加样量。其规格有10μl、20μl、25μl、30μl、50μl、100μl、200μl、250μl、300μl、400μl、500μl、1000μl等。上饶师范学院生物科学实验教学中心

⑵可调式：在一定容量范围内可根据需求进展调理取加样量。例如规格为50～200μl的可调式定量吸液器，可以在50到200μl的范围内根据需求调理成设计允许的各种取加样容量〔60μl、85μl、110μl、170μl、200μl等〕。普通来讲，固定式吸液器比较准确，可调式吸液器运用较为方便。上饶师范学院生物科学实验教学中心

3.定量吸液器的运用方法：⑴选择适当的吸液器。吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要悄然旋紧一下，以保证结合严密。⑵持法：右手四指〔除大拇指外〕并拢握住吸液器外壳〔使外壳突起部分搭在食指近端〕，大拇指悄然放在吸液器的按钮上。⑶取样(吸液)：用大拇指按下按钮到第一停顿点，以排出一定容量的空气，随后把吸嘴尖浸入取样液内，徐徐松开大拇指，让按钮渐渐自行复原，取样即告完成。上饶师范学院生物科学实验教学中心

⑷排液：将吸液器的吸嘴尖置于加样容器壁上，用大拇指渐渐地将按钮按下到第一停顿点，停留1秒钟〔粘性较高的溶液停留时间应适当延伸〕。然后再把按钮按到第二停顿点上，让吸嘴沿管壁向上滑动。当吸嘴尖与容器壁或溶液分开时，方可释放按钮，使其恢复到初始位置。⑸吸液器用后应及时取下吸嘴。将吸嘴用自来水冲洗后浸入盛水的容器内〔以防干涸〕，待实验终了后集中仔细清洗。上饶师范学院生物科学实验教学中心

三.溶液的混匀㈠混匀的目的：⒈使反响体系内的各种物质分子很好地相互接触，充分进展反响；⒉使欲稀释的溶液成为浓度均一的溶液。上饶师范学院生物科学实验教学中心

㈡混匀的方法通常有以下几种：⒈使盛器作离心运动。⒉左手持试管上端，用右手指轻击试管下半部，使管内溶液作旋转运动。⒊利用旋涡混合〔振荡〕器混匀。⒋不得已时可用枯燥清洁的玻璃棒搅匀。上饶师范学院生物科学实验教学中心

㈢混匀的本卷须知：⒈防止盛器内的液体溅出或被污染。⒉严禁用手指堵塞管口或瓶口震荡混匀。上饶师范学院生物科学实验教学中心

四.离心机的运用离心法是分别沉淀的一种方法。它是利用离心机转动产生的离心力，使比重较大的物质堆积在管底，以到达与液体分别的目的。因液体在沉淀的上部，故称清亮的液体部分为上清液。上饶师范学院生物科学实验教学中心

电动离心机的运用方法：1.将欲离心的液体，置于离心管或小试管内。并检查离心管或小试管的大小能否与离心机的套管相匹配。2.取出离心机的全部套管，并检查套管底部能否铺有软垫，有无玻璃碎片或漏孔〔有玻璃碎片必需取出，漏孔应该用蜡封住〕。检查合格后，将盛有离心液的两个试管分别放入套管中，然后连套管一同分置于粗天平的两侧，经过往离心管与套管之间滴加水来调理两边的分量使之到达平衡。上饶师范学院生物科学实验教学中心

3.将已平衡的两只装有离心管的套管，分别放入离心机相互对应的两插孔内。盖上离心机盖。翻开电源开关。逐档扭动旋钮，缓慢添加离心机转速，直至所需数值。到达离心所需时间后，将转速旋钮逐渐回零，封锁电源，让离心机自然停顿转动后〔不可人为制动〕，取出离心管。上饶师范学院生物科学实验教学中心实验一3,5—二硝基水杨酸比色定糖法

〔8课时〕目的和要求1.掌握3,5—二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。2.用3,5—二硝基水杨酸定糖法测定样品中的总糖及复原糖。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验原理3,5----二硝基水杨酸与复原糖共热后被复原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，复原糖的量和反响液的颜色强度呈现比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。该方法是半微量测糖法，操作简便，快速，杂质干扰较小。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验步骤一、葡萄糖规范曲线的绘制取9支大试管，分别按下表顺序参与各种试剂：

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将上述各管溶液混匀后，用72型分光光度计〔520nm〕进展比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值。以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制出规范曲线。

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二、样品中总糖和复原糖含量的测定1.样品中复原糖的提取：准确称取2g样品，放入100ml烧杯内，参与85％乙醇50ml，混匀，在50℃恒温水浴中保温30min，过滤，滤渣再用85％乙醇提取二次。将滤液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入100ml容量瓶中，用水定容，备用。上饶师范学院生物科学实验教学中心

2.样品中总糖的水解及提取：准确称取样品1g，放入大试管中，参与1ml6mol/L盐酸和15ml蒸馏水。混匀，在沸水浴中加热半小时后，用碘化钾－碘溶液检查水解程度，假设已水解完全，那么不呈现蓝色。冷却后参与酚酞指示剂1滴。以10％氢氧化钠中和至溶液呈微红色。过滤并定容至100ml。再准确汲取上述溶液10ml，放入100ml容量瓶中，定容，备用。上饶师范学院生物科学实验教学中心

3.样品中含糖量的测定：取7支大试管，分别按下表参与各种试剂：上饶师范学院生物科学实验教学中心

将各管混匀后，按制造规范曲线时同样的操作测定各管的光密度，在规范曲线上查出相应的复原糖含量，按下述公式推算出山芋粉内复原糖与总糖的百分含量。

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思索题1.比色测定的操作要点是什么？方法的根本原理是什么？2.72型分光光度计的原理及运用时的本卷须知是什么？3.比色测定时为什么要设计空白管？4.总糖包括哪些化合物？上饶师范学院生物科学实验教学中心实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳

〔6课时〕目的和要求1.掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作。2.定量测定血清中各种蛋白质的相对百分含量。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验原理采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素，是纤维素的羟基乙酰化所构成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂〔如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等〕后，涂抹成均匀的薄膜那么成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的构造，有强浸透性，厚度约为120μm。上饶师范学院生物科学实验教学中心

醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推行的一种新技术。它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附景象等优点。该技术已广泛运用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同功酶的分别和测定等方面。目前，醋酸纤维薄膜电泳趋向于替代纸电泳。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验步骤一、仪器和薄膜的预备1.醋酸纤维素薄膜的润湿的选择：将薄膜小心地放入盛有缓冲液的培育皿内，使它漂浮在液面。假设迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，那么阐明薄膜质地均匀；假设润湿时，薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等，那么为薄厚不匀的薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。由于，纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如，膜厚薄不均可以呵斥区带歪扭不齐、各区带界限不情、背景脱色困难、实验结果难于反复等景象。上饶师范学院生物科学实验教学中心

将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透〔约半小时〕后取出，夹在清洁的滤纸中间，悄然吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面。2.制造“滤纸桥〞：剪裁尽寸适宜的滤纸条。取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电泳槽的缓冲液内。然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥〞。按照同样的方法，在另一个电泳槽的支架上制造一样的“滤纸桥〞。它们的作用是联络醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁〞。上饶师范学院生物科学实验教学中心

3.平衡：用平衡安装〔或自制的平衡管〕，使两个电泳槽内缓冲液的液面彼此处于程度的形状。普通需求平衡15～20min。留意，平衡后应将平衡安装的活塞关好〔或除去平衡管〕。上饶师范学院生物科学实验教学中心

二、点样在薄膜无光泽的一面点样。点样区距负极端1.5㎝处。点样时，先用血色素吸管将2～3微升的血清均匀地涂在点样器外表，再用点样器“印〞在薄膜的点样区内〔见以下图〕。留意。应使血清均匀分布在点样区，构成具有一定宽度、精细匀称的直线，切不可用力过大把薄膜弄破。事先可在滤纸上练习点样，掌握点样技术，这是获得具有明晰区带的电泳图谱的重要环节之一。上饶师范学院生物科学实验教学中心

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三、电泳将已点样的薄膜使无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥〞上，参照以下图。平衡10min，仔细检查电泳安装的线路能否正确，然后,通电。翻开电源开头，调理电压和电流强度，先旋动仪器粗调旋钮，再旋动细调旋钮。调理到薄膜每厘米宽的电流强度为0.3mA，通电10～15min后，再将电压和电流强度提高到薄膜每厘米长度电压为10V左右，薄膜每厘米宽的电流强度为0.4～0.6mA。在电泳过程中，应留意控制电压和电流强度，防止过高或偏低。待电泳区带展开约3.5㎝时，那么并闭电源，普统统电时间为60min左右。上饶师范学院生物科学实验教学中心

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四、染色电泳终了立刻取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。然后，用漂洗液浸洗，每隔10min左右换一次漂洗液，延续改换三次，可使背景颜色脱去。将膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。操作中，要留意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。上饶师范学院生物科学实验教学中心

五、结果判别普通的染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。上饶师范学院生物科学实验教学中心

六、透明将染色后漂洗干净的薄膜用吹风机吹干，再浸入透明液的甲液中，浸泡2min后立刻浸入透明液的乙液中，浸泡1min〔要准确〕，然后迅速取出薄膜，将它紧贴在玻璃板上，不要存留气泡。大约2～3min内的薄膜完全透明，放置10～15min后，用吹风机将膜吹干。在水笼头下将玻璃板上透明的薄膜润湿后，用单面刀片从膜的一角撬起，并划开一端，再用手捏住撬起的膜悄然撕下，可以容易地从玻璃板上取下透明的薄膜。用滤纸吸干，浸入液体石腊中，约３min后取出。再用干净的滤纸吸干，压平，那么成为色泽艳丽而又透明的血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱，可长期保管不褪色。上饶师范学院生物科学实验教学中心

七、定量未经透明处置的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱可直接用于定量测定。普通采用洗脱法或光密度计法，测定各蛋白质组分的相对百分含量。上饶师范学院生物科学实验教学中心

１．洗脱法：将电泳图谱的各区带剪下，分别浸入盛有0.4mol/L氢氧化钠溶液的试管中，清蛋白管参与4ml，其他每管各加２ml，摇匀，放入37℃恒温水浴上浸提30min，每隔10min，充分摇动一次，以便将色泽完全洗脱下来。该溶液颜色较稳定，在室温下24小时内颜色强度无显著变化。然后在620nm波优点比色，测定各管的光密度值为O.DA、O.Dα1、O.Dα２、O.Dβ、O.Dγ。按以下方法计算血清各部分蛋白质所占百分率。上饶师范学院生物科学实验教学中心

〔１〕先计算光密度值总和〔简写为Ｔ〕：

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〔２〕再计算血清各部分蛋白质所占百分率〔即相对百分含量〕：上饶师范学院生物科学实验教学中心

正常值：清蛋白54.0～73.0；α１球蛋白2.8～5.1%；α2球蛋白6.3～0.6%；β球蛋白5.2～1.0%；γ球蛋白12.5～0.0%。上饶师范学院生物科学实验教学中心

２．光密度计法：将枯燥的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱放入自动扫描光密度仪〔或色谱扫描仪〕内，经过反射〔运用未透明的薄膜时〕或透射〔用已透明的薄膜时〕方式，在记录器上自动绘出血清蛋白质各组分曲线图，横坐标为膜的长度，纵坐标为光密度〔或光强度〕，每一个峰代表一种蛋白质组分。然后，用求积仪丈量出各峰的面积，计算每个峰的面积与它们总面积的百分比就代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。或将曲线图上各峰沿曲线剪下，称量各峰的分量，计算每个峰的分量与它们总分量的查分比也可以代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。在使器具有电子计算机附件的自动扫描光密度仪时，可以由显示部分或打字带上获得血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱上每条区带所代表的蛋白质组分的含量。上饶师范学院生物科学实验教学中心

思索题指出醋酸纤维素薄膜用作电泳的支持物有何优点？上饶师范学院生物科学实验教学中心

备注①染色液、漂洗液和透明液应在密封的瓶子内储存。否那么，易挥发的成分蒸发，使溶液各组分配比发生改动，影响实验结果。在气侯温度较高的季节，更要非常留意，特别是透明液。②电泳时间的长短，应以获得血清各组分的最正确分别效果为规范。由于，运用不同型号电泳仪进展实验，有时所需电泳时间差别较大。另外，电泳时产生大量的热，为了获得反复性强、区带明晰的电泳图谱，应运用冷却安装降温。在炎热的夏季，更为必要。上饶师范学院生物科学实验教学中心实验三总氮量的测定——微量凯氏〔Micro-Kjeldahl〕定氮法

〔8课时〕目的和要求1.学习微量凯氏定氮法的原理。2.掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括规范梳酸铵含氮量的测定、未知样品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验原理天然有机物〔如蛋白质、核酸及氨其酸等〕的含氮量用凯氏定氮法来测定。当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反响进展得很慢，可参与硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反响。上饶师范学院生物科学实验教学中心

消化完了后，在凯氏定氮仪中参与强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量规范无机酸溶液中，然后用规范碱溶液进展滴定，准确测定氨量，从而折算出含氮量。以甘氨酸为例，该过程的化学反响如下：上饶师范学院生物科学实验教学中心

测定时常用硼酸溶液搜集氨，氨与溶液中的氢离子结全，生成铵离子，使溶液中氢离子浓离降低。然后再用强酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。所用的强酸的当量数即相当于被测样品中氨的当量数。本法适用的范围为0.2-1.0mg氮。相对误差应小于±2%。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验步骤一、样品处置血清样品：取人血或猪血〔蛋白质样品含水量普通为10%～12%〕，放于离心管中，于冰箱中放置过夜，次日离心除去血凝块，上层黄色透明清液，即为血清。吸出1ml血清，加到50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，混匀备用。溶液如显浑浊，加少量氯化钠，再混匀。上饶师范学院生物科学实验教学中心

固体样品：测定某一固体样品中的含氮量，是按100克该物质的的干重所含的氮克数来表示〔%〕。因此在定氮前应先将固体样品中的水分除掉。操作时先将样品磨细，在称量瓶中称入一定量的样品，再置于105℃的烘箱内烘烤1小时。用坩埚钳将称量瓶放入枯燥器内，待降至室温后称重。按上述操作，每烘干1小时后反复称量一次，直至两次称量数值不变，即到达恒重为止。上饶师范学院生物科学实验教学中心

二、消化预备4个50ml的凯氏烧瓶，并标号，向第1、2号烧瓶内各参与2ml稀释血清溶液〔或4ml核酸制品溶液，或200mg固体粉末〕。留意，用吸量管直接将溶液〔或用试管参与固体样品〕加至烧瓶底部，切勿沾于瓶品及瓶颈上。向3、4号烧瓶参与2ml水，作为空白对照，丈量试剂中能够含有的微量含氮物质，以对样品进展校正。上饶师范学院生物科学实验教学中心

在每个烧瓶中参与约300mg硫酸钾-硫酸铜混合物，再用量筒参与化学纯浓硫酸3ml，将以上4个烧瓶放到消化架上〔见图4-1〕，〔如无消化架，可将烧瓶放在置于通风橱内或通风处的电炉上〕进展消化。接好抽气安装，调理煤气量。先用小火焰加热煮沸，首先看到烧瓶内物质碳化变黑，并产生大量泡沫，此时要特别留意，不能让黑色物质上升到烧瓶颈部，否那么将严重地影响样品的测定结果。上饶师范学院生物科学实验教学中心

当混合物停顿冒泡，蒸汽与二氧化硫也均匀地放出时，将火焰调理到使瓶内液体悄然沸腾。假设在瓶颈上发现有黑色颗粒，应小心地将烧瓶倾斜振摇，用消化液体将它冲洗下来，在消化中要时常转动烧瓶，使全部样品都侵泡在硫酸内，以便在微沸的硫酸含中不断消化，消化液在轻度迥流的情况下大约维持6～8小时〔对于那些赖氨酸含量较高的蛋白质样品甚至需求12小时〕。上饶师范学院生物科学实验教学中心

待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30%过氧化氢溶液1～2滴，加到瓶底消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成明晰的淡蓝绿色，消化即告完成〔固体样品约需7小时〕。为了保证反响的彻底完成，再继续加热消化1小时。消化结束，封锁煤气灯，使烧瓶冷却室温。上饶师范学院生物科学实验教学中心

三、蒸馏1.仪器的洗涤：仪器应先经普通洗涤，再经水蒸汽洗涤。普通洗涤是先用水洗净棒状玻塞〔见以下图〕周围，每次实验后要洗去氢氧化钠溶液，以防样品参与时立刻放氨。上饶师范学院生物科学实验教学中心

运用前全部蒸馏安装必需用水蒸汽充分洗涤。用水蒸汽洗涤蒸馏器的目的在于洗去冷凝管中能够残留的氨。对于处于运用形状的仪器〔尤其是正在测定中的仪器〕，加样前使蒸汽经过1～2min即可，对于较长时间未运用的仪器，必需用水蒸汽洗涤到吸收蒸汽的硼酸-指示剂混合液中指示剂颜色合格为止，洗涤方法如下：上饶师范学院生物科学实验教学中心

取2～3个50ml的维形瓶，参与5ml左右2%硼酸-指示剂混合液，用外表皿覆盖备用。先煮沸蒸汽发生器〔见上图〕，器中盛有用几滴硫酸酸化过的蒸馏水，并加几滴甲基红指示剂蒸馏器中还应放入一些毛细管，它们的长度必需超越液面，也可以用一些玻璃珠或小段橡皮管，它们都有防止爆沸的作用，封锁夹子9，使蒸汽经过反响室7中的插管10，进入反响室，再由冷凝器11的下端逸出。上饶师范学院生物科学实验教学中心

在冷凝器下端放一只空烧杯以接受凝集的水滴。这样用蒸汽洗涤5min左右后，在冷凝器下口放一个盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶12，位置如上图，冷凝器下端应完全浸没于液体内，继续用蒸汽洗涤1～2min。察看锥形瓶中溶液能否根本上不变色，假设不变色，那么证明蒸馏器内部洗涤干净。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实践上因指示剂极为灵敏，很难到达完全不变色。含有指示剂的硼酸溶液，紫褐色，即使不接纳氨蒸汽，只放在室内的桌面上，几分钟后，也能够会因吸收了空气中的CO2而变色，因此，在操作过程中应保证硼酸溶液不被其它试剂反污染〔这点很重要〕。上饶师范学院生物科学实验教学中心

洗涤较长时间未运用的仪器，用硼酸-指示剂混合液于冷凝管下品接纳蒸汽时，假设1～2min后溶液未变成鲜绿色，而只变成灰色或暗绿色，即可以为是根本上未变色，仪器已洗净。向下挪动锥形瓶，使硼酸液面分开冷凝管口约1，继续通蒸汽1min，最后用水冲洗冷凝管外口，移开火焰，翻开夹子，可预备样品测定。上饶师范学院生物科学实验教学中心

2.样品及空白蒸馏：加样前先撤火1〔熟练后此步可省去，不撤〕，并务必翻开夹子9〔这是本实验关键之一，否那么，样品会被倒抽到反响器外〕。取下棒状玻塞6，用吸管汲取2ml消化液，细心地插到反响器小玻杯的棒状玻玻6的下方。这步必需真实做到，以免加碱后氨立刻挥发逸走，让反响液流入反响室7中，塞上棒状玻塞，取1只盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，放在冷凝器之下口，冷凝器下口必需在硼酸注面之下〔这是本实验关键的一步〕。上饶师范学院生物科学实验教学中心

此锥形瓶在加碱液〔30%氢氧化钠溶液〕前或者也可以加样品之前就放在冷凝管下口，并使下口浸入，目的是保证全部吸收氢氧钠溶液与样品接触时放出的氨。用量筒向小玻杯5参与10ml30%氢氨化钠，加完后，悄然地旋转着向上提起棒状玻塞〔小玻杯5极易损坏，提放玻塞时就小心操作〕，使碱液渐渐流入反响室7，在碱液尚未守全流入时，将玻塞盖紧，向小玻杯5中参与约5ml蒸馏水。再轻提玻塞，使一半蒸馏水流入反响室，另一半留在玻杯中水封。上饶师范学院生物科学实验教学中心

蒸馏：用煤气灯1加热水蒸汽发生器，沸腾后，夹紧夹子9，开场蒸馏。锥形瓶中硼酸-指示剂混合液吸收氨，由紫色变为绿色，自变色起记时，蒸馏3～5min。挪动锥形瓶，使硼酸液面分开冷凝管口约1，并用少量蒸蒸馏水洗涤冷凝管下口外面，继续蒸馏1min。拿开锥形瓶，用外表皿覆盖瓶口。按以上操作再蒸馏二次后，三瓶一同滴定，再进展消化空白液的蒸馏。上饶师范学院生物科学实验教学中心

排废液及洗涤：一次蒸馏终了后，为了排出反响后的废液，在小玻杯中倒入冷蒸馏水，并加大煤气灯火焰。待蒸汽很足，反响室外壳7温度很高〔烫手，这时反响室下方的夹子9是紧闭的〕，反响室中液体沸腾，延续不断冒泡后，于右手轻提捧状玻塞，使冷水流入反响室的同时，立刻左手用劲捏橡皮管4，这时因反响室外壳8中的蒸汽比反响室7中的多，遇冷收缩较大，压力应力降低较多，结果，反响室7废液经过的反响室中的插管10自动地被抽到反响室外壳中。上饶师范学院生物科学实验教学中心

塞住玻塞，取蒸馏水约20ml，参与小玻杯，提起玻塞，冷水再流入反响室，又自动抽出，如此反复几次即可排尽应废液及洗涤废液。假设外壳中已有较多的废液，可待反响室外壳蒸热后，右手捏夹子9，放出一些废液，左手立刻捏一下橡皮管4，积存液即从反响室中排出，这样左右手交替几次，也可排出反响室内的液体。如此冲洗3～4次。翻开夹子9，排出反响室外壳中积存的废液，封锁夹子9，再用蒸汽经过会套蒸馏仪数分钟后，继续下一次蒸馏。上饶师范学院生物科学实验教学中心

“样品〞及“规范〞，因含氨极多，硼酸运用液吸收大量氨蒸汽后，颜色发生明星突变，由暗绿忽然地变为鲜绿色。“空白〞因含氨极少，无明显的颜色突变。上饶师范学院生物科学实验教学中心

3.滴定：全部蒸馏终了后，用0.0100N规范盐酸溶液滴定各锥形瓶中搜集的氨量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。上饶师范学院生物科学实验教学中心

四、计算假设测定的样品含氮部分是蛋白质〔如血清〕，那么：式中：A为滴定样品用去盐酸平均毫升数：B为滴定空白用去盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数；0.0100为盐酸的当量浓度〔实践上，此项应按实验中运用盐酸的实践浓度填写〕；14为氮的原子量；6.25为系数〔1ml0.01N盐酸相当于0.14mg氮〕。上饶师范学院生物科学实验教学中心

假设样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，那么样品蛋白质含量的测定要复杂一些。首先，需向样品中加氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后检验定未加三氯乙酸的样品及参与三氯乙酸后样品的上清液中的含量氮量，得出非蛋白氮量及总氮量，从而计算出蛋白质⑤，再进一步折算出蛋白质含量。蛋白氮=总氮-非蛋白氮蛋白质含量〔克/%〕=蛋白氮×6.25上饶师范学院生物科学实验教学中心

思索题1.指出以下试剂的作用：〔1〕消化含氮样品时运用的浓硫酸、硫酸钾及硫酸铜粉末。〔2〕蒸馏滴定中的30%氢氧化钠溶液、2%硼酸溶液及2%硼酸溶液中的指示剂。2.指出本测定方法产生误差的缘由。3.正式测定未知样品前为什么必需测定规范硫酸铵的含氮量及空白？4.写出以下各步的化学反响式：〔1〕蛋白质消化〔2〕氨的蒸馏〔3〕氨的滴定上饶师范学院生物科学实验教学中心

备注①蒸馏时实验室中切忌有碱性雾气〔如氨〕，否那么将严重地影响实验结果的准确度。②假设反响室内液体太多，超越1/2，又不易排出时，只能拆开仪器倒出贮液。但是普通尽量防止发生此种情况。折卸时应特别小心，防止损坏仪器。装配仪器应首先放松用来固定冷凝管的万能夹，然后小心地将冷凝管向下错开，待反响室外壳与冷凝管分开后，再挪动反响室。上饶师范学院生物科学实验教学中心

③“空白〞滴定值包括水及氢氧化钠溶液中含有的微量的氨。因些，水质对“空白〞滴定值的影响甚大。“消化样品〞最后用“消化空白〞进展校正计算，“不消化的样品〞最后用“不消化的空白〞进展校正计算。而且，在实验中，稀释样品的水与“空白〞的水该当取自于同一瓶中。上饶师范学院生物科学实验教学中心

④蛋白质是一类复杂的含氮化合物，其中每一种蛋白南都有恒定的含氮量，普通大约为14-18%，平均为16%。由凯氏定氮法测出含氮量，再乘以系数6.25〔即每含氮1g，就表示该物质含蛋白质6.25g〕即为蛋白质量。⑤最好将三氯乙酸沉淀的蛋白质部分再去消化，消化后测含氮量，这个含氮量应相等于由总氮及非蛋白氮计算的蛋白氮量。但操作费事一些。上饶师范学院生物科学实验教学中心实验四脂肪碘值的测定

〔4课时〕目的和要求1.学习脂肪碘值测定的原理和方法。2.了解测定脂肪碘值的意义。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验原理脂肪中，不饱和脂肪酸链上有不饱和键，可与卤素(Cl2,Br2,I2)进展加成反响，不饱和键数目越多，加成的卤素量就越多，通常以“碘值〞表示。在一定条件下，每100g脂肪所吸收的碘的克数称为该脂肪的“碘值〞。碘值越高，阐明不饱和脂肪酸的含量越高，它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。本实验运用溴化碘(IBr)进展碘值测定。IBr的一部分与不饱和脂肪酸起加成作用，剩余部分与碘化钾作用放出碘，放出的碘用硫代硫酸钠滴定。详细反响过程如下：加成反响：─CH═CH─+IBr─→C2H2IBr释放碘：IBr+KI─→KBr+I2滴定：I2+2Na2SO4─→2NaI+Na2S4O6上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验步骤准确地称取0.3—0.4g花生油2份，置于两个枯燥的碘瓶内，切勿使油粘在瓶颈或壁上。参与10ml四氯化碳，悄然摇动，使油全部溶解。用滴定管仔细地参与25ml溴化碘溶液〔Hanus溶液〕，勿使溶液接触瓶颈。盖好瓶塞，在玻璃塞与瓶口之间加数滴10%碘化钾溶液封锁缝隙，以免碘的挥发损失。上饶师范学院生物科学实验教学中心

在20—30℃暗处放置30min，并不时悄然摇动。放置30min后，立刻小心地翻开玻璃塞，使塞旁碘化钾溶液流入瓶内，切勿丧失。用新配制的10%碘化钾10ml和蒸馏水50ml把玻璃赛和瓶颈上的液体冲洗入瓶内，混匀。用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液迅速滴定至浅黄色。参与1%淀粉溶液约1ml，继续滴定。将近终点使，用力振荡，使碘由四氯化碳层全部进入水溶液内。上饶师范学院生物科学实验教学中心

再滴定至蓝色消逝为止，即达滴定终点。另作2份空白对照，除不加样品外，其他操作同上。滴定后，将废液倒入废液缸内，以便回收四氯化碳。计算碘值按下式计算碘值：碘值=〔A-B〕×T×100/C式中，A=滴定空白用去的Na2S2O3溶液的平均毫升数，B=滴定碘化后样品用去的Na2S2O3溶液的平均毫升数，C=样品的分量(g)，T=1ml0.1mol/L硫代硫酸钠溶液相当的碘的克数。上饶师范学院生物科学实验教学中心

思索题1.测定碘值有何意义？液体油和固体脂碘值之间有何区别？2.参与溴化碘溶液后，为何要在暗处存放30min？3.滴定过程中，淀粉溶液为何不能过早参与？4.滴定终了放置一些时间后，溶液前往蓝色，否那么表示滴定过量，为什么？上饶师范学院生物科学实验教学中心

备注①碘瓶必需洗净，枯燥，否那么瓶中的油中含有水分，引起反响不完全。参与碘试剂后，如发现碘瓶中颜色变成浅褐色时，阐明试剂不够，必需再添加10—15ml试剂。②如参与碘试剂后，液体变浊，这阐明油脂在CCl4中溶解不完全，可再加些CCl4。③将近滴定终点时，用力振荡是本滴定成败的关键之一，否那么容易滴过头或缺乏。如振荡不够，CCl4层会出现紫色或红色。此时该当用力振荡，使碘进入水层。④淀粉溶液不宜加得过早。否那么，滴定值偏高。上饶师范学院生物科学实验教学中心实验五维生素C的定量测定

〔4课时〕目的和要求1.学习定量测定生素C的原理和方法。2.进一步掌握滴定法的根本操作技术。3.了解蔬菜中维生素C的含量。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验原理维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸。它是具有L系糖构型的不饱和多羟化合物，属于水溶性维生素。维生素C分布很广，植物的绿色部分及许多水果〔桔类、草莓、山楂、辣椒等〕的含量更为丰富。维生素C具有很强的复原性。在碱性溶液中，加热并有氧化剂存在时，抗坏血酸易被氧化面破坏。在中性和微酸性环境中，抗坏血酸能将染料2，6－二氯酚靛酚复原成无色的复原型2，6－二氯酚靛酚。同时将抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸。上饶师范学院生物科学实验教学中心

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氧化型2，6－二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。因此，当用2，6–二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸尚未全部被氧化时，滴下的2，6–二氯酚靛酚立刻被复原成无色。但溶液中的抗坏血酸一旦全部被氧化时，那么滴下的2，6–二氯酚靛酚立刻呈现红色。所以，当溶液从无色转变成微红色时，即表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。此时即为滴定终点。从滴定时2，6–二氯酚靛酚规范的耗费量，可以计算出被检物质中抗坏血酸的含量。上饶师范学院生物科学实验教学中心

该法简便易行，但有以下缺陷：①在生物组织内和组织提取物内，抗坏血酸还能以脱氢抗坏血酸及结合抗血酸的方式存在。它们同样具有维生素C的生理作用，但不能将2，6–二氯酚靛酚复原脱色。②生物组织提取物和生物体液中常含有其他复原性物质，其中有些也可以在同样实验条件下使2，6–二氯酚靛酚复原脱色。③在生物组织提取物中，常有色素类物质存在，给滴定终点的察看呵斥困难。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验步骤用分析天平准确地称取样品约0.5克。样品必需用温水洗去泥土，并在空气中风干。放入研钵中，加1％盐酸溶液5～10ml一同研磨。放置片刻，将提取液滤入50ml容量瓶。如此反复抽提2～3次。最后用1％盐酸液稀释到刻度并混匀。每次量取5ml放入小锥形瓶内进展滴定。上饶师范学院生物科学实验教学中心

用微量滴定管，以0.001N2，6–二氯酚靛酚溶液〔蓝色〕滴定至提取液呈现淡粉红色，并坚持15～30秒不褪。滴定过程必需迅速，不要超越2min。由于在本滴定条件下，一些非维生素C复原物质的复原作用较缓慢，快速滴定右以防止或减少它们的影响。要使结果准确，滴下运用的2，6–二氯酚靛酚钠在1～4ml之间，假设滴定结果超越此范围，那么必需增减样品用量或交提取液适当稀释。另取5ml1％盐酸作空白对照滴定。上饶师范学院生物科学实验教学中心

提取液和空白对照各做三份，对结果取平均值进展计算。计算：式中：VA为滴定样品提取液所耗用的2，6–二氯酚靛酚的平均毫升数；VB为滴定空白对照所耗用的2，6–二氯酚靛酚的平均毫升数；C为样品提取液的总毫升数；D为滴定时所取的样品提取液毫升数；W为被检样品的质量。T为1毫升规范0.001N2，6–二氯酚靛酚溶液相当维生素C的毫克数，T的详细数目为mg/ml。上饶师范学院生物科学实验教学中心

思索题指出本实验采用的定量测定维生素C的方法有何优缺陷？上饶师范学院生物科学实验教学中心实验六小麦萌生前后淀粉酶活力的比较

〔6课时〕目的和要求1．学习分光光度计的原理和运用方法。2．学习测定淀粉酶活力的方法。3．了解小麦萌生前后淀粉酶活力的变化。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验原理种子中贮藏的碳水化合物主要以淀粉的方式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。2〔C6H10O5〕n＋H2O-------nC12H22O11麦芽糖有复原性，能使3,5-二硝基水杨酸复原成棕色的3-氨基5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计法测定。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验步骤1．种子发芽：小麦种子浸泡2.5小时后，放人25℃恒温箱内或在室温下发芽。2．酶液提取：取发芽第三天或第四天的幼苗15株，放人乳钵内，加海砂200毫克，加1％氯化钠溶液10毫升，用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅拌几次。将提取液离心〔l500转／min〕6－7分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进展酶活力测定时，将酶提取液稀释10倍。取枯燥种子或浸泡2.5小时后的种子15粒作为对照〔提取步骤同上〕。上饶师范学院生物科学实验教学中心

3．酶活力测定：〔1〕取25毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂〔各试剂须25℃预热10分钟〕。上饶师范学院生物科学实验教学中心

将各管混匀，放在25℃，水浴中保温3分钟后，立刻向各管中加人10％3,5-二硝基水杨酸溶液2毫升。〔2〕取出各试管，放人沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至25毫升。将各管充分混匀。〔3〕用空白管作对照；在500毫微米处测定各管的光吸收值，将读数填入上表。上饶师范学院生物科学实验教学中心

4．计算根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A规范／A未知＝C规范／C未知那么C〔酶液管浓度〕＝A酶×C规范／A规范式中C代表浓度；A为光吸收值。上饶师范学院生物科学实验教学中心

思索题1．为什么要将各试管中的溶液置于25℃水浴中保温？上饶师范学院生物科学实验教学中心实验七组织DNA的提取纯化

〔8课时〕目的和要求学习从鼠肝中提取动物DNA的方法。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验原理DNA是储存遗传信息的物质，是遗传的物质根底，它与生命的正常活动如种厉遗传、生长发育有亲密关系。其构造与功能的研讨是当前分子生物学研讨的主要内容之一。上饶师范学院生物科学实验教学中心

核酸广泛存在于生物中，DNA含有生物体的全部遗传信息，在生物组织中以核蛋白(DNP)方式存在。真核生物中，DNA主要存在于细胞核中，核外也有少量，如线粒体DNA，称为核外基因。DNA的分子长度普通随生物由低级进化到高级而添加。人类基因组含2.9×109bp。上饶师范学院生物科学实验教学中心

无论是研讨核酸的构造，还是它的功能，首先需求对核酸进展分别与提纯。分别与提纯核酸最根本的要求是坚持核酸的完好性及纯度。要从生物组织中提取DNA，DNA是以核蛋白(DNP)方式存在于细胞核中故首先必需粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使DNP释放出来，再用苯酚提取蛋白。由于细胞中的核糖核蛋白(RNP)和DNP往往一同被提取，故DNA沉淀中混有RNA。上饶师范学院生物科学实验教学中心

需用核糖核酸酶(RNase)处置，去除RNA。并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去，再经苯酚处置，乙醇沉淀，最后可得较为纯真的DNA。它的纯度可以从260nm波优点的光密度和280nm波优点的光密度之比值测知，普通以O.D260nm／O.D280nm能到达1.8左右为规范。上饶师范学院生物科学实验教学中心

分别与提纯过程中坚持DNA的完好性和纯度存在许多困难，主要缘由有：(1)细胞内存在很高的DNA酶活性，在分别与提纯过程中会呵斥核酸的降解。上饶师范学院生物科学实验教学中心

(2)DNA分子很大，分别过程中因化学要素或物理要素使DNA降解，如强酸、强碱、温度过高或机械张力剪切等。DNA的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时参考：双链DNA含量：O.D260nm×样品稀释倍数×50ug／ml=ug/m1样品。上饶师范学院生物科学实验教学中心

实验步骤1．取新颖鼠肝用冰生理盐水洗去血水，用滤纸吸千后，—70℃冰箱中保管，用时取出。上饶师范学院生物科学实验教学中心

2.1克鼠肝加10ml裂解缓冲液，在组织匀浆器中匀浆约1分钟(2次，每次0.5分钟)3．取塑料离心管1支参与1／3匀浆液(假设匀浆液太稠，那么再参与lmlTE缓冲液)，然后再参与等体积苯酚：氯仿混和液抽提。每次抽提轻缓地来回摇动5分钟，然后离心10000转／分钟×5分钟，水相吸入另一干净的离心管中，反复抽提二次。留意：每次水相时不要将界面上的变性蛋白质混入，抽提二次后普通有机相和水相界面上的变性蛋白质极少，肉眼根本看不见。假设界面上变性蛋白质仍较多，可添加抽提次数。上饶师范学院生物科学实验教学中心

4．水相参与一刻度离心管中后，参与2.5倍体积的冰无水乙醇(可用刻度离心管丈量体积)，加5mol／LNaCl到终浓度为0.1mol／L，在离心管中轻缓的混匀，此时可见白色絮状沉淀，此即DNA粗