《医学微生物学与免疫学》实验讲义

《国辔微金物学鸟无谖学》

实除将文

目录

微生物部分

基础验证性实验

实验一细菌基本形态的观察

实验二细菌特殊结构的染色和观察

实验三细菌培养

实验四细菌的分布与无菌操作技术

实验五消毒灭菌

实验六抗链球菌溶血素“0”试验

实验七厌氧性细菌

实验八分枝杆菌属

实验九螺旋体

实验十其他细菌

实验十一病原性真菌的检测

实验十二病毒的分离培养

实验十三病毒血凝试验

综合设计性实验

实验十四细菌的生化反应

实验十五病原性球菌感染检查与鉴定

实验十六肠道杆菌的检测

免疫学部分

实验室规则

实验一凝集反应

实验二沉淀反应

实验三细胞分离技术及E花环形成试验

实验四变态反应试验

实验五免疫标记技术

实验六吞噬功能的检测

实验七白细胞介素-2(IL-2)生物学活性测定

基础验证性实验

实验一细菌基本形态的观察

由于细菌个体微小，需借助显微镜，才能够看清细菌的形状、大小、结构、排列及染色

特性等。因此，同学们首先要熟练掌握油镜的使用及保护。

一、显微镜油镜头的使用及保护

【使用原理】

显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。油镜的透镜很小，光线通过玻片与油

镜头之间的空气时.，因介质密度不同，发生折射或全反射，使射入透镜的光线减少，物象显

现不清。若在油镜与载玻片之间加入和玻璃折射率相近的香柏油和液体石蜡，避免光线散射,

使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，观察物象更加清楚。

1、光线C、D、C'、D'通过载玻片经香柏油

折射，使进入物镜中的光线量较多。

2、光线A、B、A'、B'通过载玻片经空气折

射，使进入物镜中的光线量减少。

图1-1油镜的使用原理

【操作方法】

1.物镜的放大率可由其外形辨认，镜头长度越大，镜片直径越小，放大倍数越大；反之,

放大倍数越小。油镜头长度大于低、高倍镜，镜头下缘一般刻有一圈黑线、白线或蓝线，并

刻有100X或oil等字样。

2.使用显微镜油镜时，必须将显微镜端正直立桌上，不得将镜臂弯曲，以免使载物台倾

斜，松柏油流溢，影响观察，污染台面。

3.调试：打开电源，先采用低倍镜，上下移动集光器和光圈，使视野达到清晰光亮。将

标本片固定于载物台上，镜头对准标本面，先用低倍镜找出标本的位置，转动粗螺旋使镜筒

上升，在标本的待检部位滴加一滴香柏油，改换油镜头观察。

4.调焦距：

⑴转动粗螺旋使载物台徐徐上升，同时眼睛从右侧观察镜筒下降程度，至油镜头浸入

油中。小心操作，以免压碎标本片或损坏镜头。

⑵用双眼观察目镜，反方向缓慢地转动粗螺旋，下降载物台，待看到模糊物象时，换

用细螺旋，转动至物象完全清晰为止。

1

⑶观察时只用细螺旋调节，需改换视野时，右手操纵推进器，左手转动细螺旋，做到

配合自如。并养成左眼观察，右眼绘图的习惯。

（4）实验完毕，先提高镜筒，并将油镜头扭向一侧，再取下标本片。油镜头使用后须用

擦镜纸滴加适量酒精和乙醛混合液（7：3）将镜头上的油擦洗干净。不用时将物镜转成“八”

字形，载物台降至低点，下降集光器，关上光圈，套上保护罩，双手平托放回原处。

图1-2普通光学显微镜结构图

【油镜头的保护】

1.显微镜是精密仪器，使用时要注意爱护，切勿随意拆卸和碰撞。

2.强酸、强碱、氯仿、酒精、乙醛等都能去漆或损坏机件，均需注意不使其接触显微镜。

3.细调节器是显微镜最精细、最脆弱的机械部分，每旋转一周使镜筒上升或下降0.1毫

米，只能往返回转，即向一个方向转动数周，遇阻力时，应反方向转动。

4.显微镜不用时放入镜柜，避免直射日光，置于干燥处，以防受潮。

【注意事项】

1.显微镜使用时，如发现问题或配件短缺应及时向老师报告并进行登记，以便检修。

2.观察不染色标本时，需下降集光器并适当地缩小光圈，使光度减弱；观察染色标本时,

光度宜强，应将显微镜亮度开关调至最亮，光圈完全打开，并上升集光器至与载物台相平。

3.使用直筒显微镜观察标本时，必须两眼同时睁开，训练使用左眼观察，右眼绘图。

如用油镜头观察，勿将镜身歪斜，避免镜油流出片面。

4.使用完毕，勿必擦去镜头油。

二、细菌基本形态观察（示教）

1.球形：葡萄球菌G,——菌体正圆形，染成蓝紫色，呈现葡萄串状排列。G，球菌。

2

2.杆形：大肠杆菌G--—菌体短杆状，染成红色，呈不规则分散排列。G杆菌。

3.螺形：霍乱弧菌G一一一菌体弧形，染成红色，呈不规则分散排列。G弧菌。

三、革兰染色法（操作）

细菌革兰染色有助于鉴别细菌。

【原理】

细菌的等电点较低，约在pH2〜5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电

离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合，使细菌被染成紫色或

红色。革兰染色是细菌学中使用最广泛的一种染色方法，籍此染色法，可将所有细菌区分为

两大类。

【材料】

1.葡萄球菌、大肠杆菌18~24小时普通琼脂斜面培养物。

2.革兰染色液。

3.生理盐水，载物玻片，接种环等。

【方法】

1.制片：

1）灭菌：接种环以15。角置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌（图1-3）,直至金属丝烧红，然

后将金属柄部也回旋通过火焰烧灼灭菌，重复三次。

2）涂片：

①取清洁无油污载物玻片一张，已灭菌接种环沾取生理盐水1〜2环置于玻片中央。

②用右手小指和手掌小鱼肌侧拔下左手所持菌种的试管盖，并立即火焰烧灼试管口灭

菌。

③再用己灭菌冷却接种环伸入试管中，沾取少许葡萄球菌或大肠杆菌菌苔，混于生理盐

水中，轻轻涂成均匀薄膜。

④再次灭菌试管口，盖好试管，放回原处。

⑤然后将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接

种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。（若菌种为脓

液、痰液等液体标本，注意取菌液时（图1-4）勿使沾有菌液的接种环触及试管壁及试管口。

3）干燥：最好在室温自然干燥，如需加速干燥，也可将涂面向上，远离火焰上方微加温

干燥（离火焰20cm处，切勿加热过度，以防将标本烧枯）。

4）固定：标本干燥后，用加热固定法固定。常玻片有菌膜的面向上，在火焰的最热部

分通过酒精灯火焰三次（约2〜3秒钟），固定的目的是杀死细菌使之固定于玻片上，并使细

菌蛋白变性，以改变菌体对染料的通透性。

2.染色：根据不同的染色要求使用相应染色液进行染色。

①初染：于涂抹面上滴加结晶紫染液1〜2滴，覆盖涂面，室温染色一分钟。用细流水冲

洗剩留染液，甩去片上积水。

②媒染：滴加卢戈碘液，室温作用一分钟，细流水冲洗，甩去积水。

③脱色：将载玻片浸于95%酒精缸中，上下提取，边提边看，直至涂面流下的液体无

色为止（约30秒钟）。细流水冲洗，甩去积水。

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图1-3接种环灭菌图1-4试管中取菌

④复染：加稀释石炭酸复红染液1〜2滴，染色30秒钟，细流水冲洗，吸水纸吸干玻片水

分。

3.油镜检查

【结果】染色片待干后，于油镜下，调强光视野观察，呈紫色的为革兰阳性菌，呈红色

的为革兰阴性菌。葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性，以G+表示；大肠杆菌染成红色，为革

兰阴性，以G-表示。

【注意事项】

1.脱色是革兰染色中的关键步骤，脱色过度，可使G+菌被误染为G'菌；脱色不够，

则G-菌可被误染为G+菌。脱色时间的长短还与涂片厚薄有关，一般以涂片薄而均匀为好。

2.G.菌与G-菌的染色反应，还受多种因素如菌龄、染色时间、pH等的影响，只有严

格正规操作，才能得到正确结果。

【附注】

1.与医学有关的常见细菌的革兰染色性：见下页。

2.革兰（Gram）染色液的配制

（1）结晶紫染液

①结晶紫酒精饱和液：取14g结晶紫溶于100ml95%的酒精内。

②1%草酸镂水溶液：草酸铁0.8g溶于80ml蒸储水中。

③将已配好之①液20ml和②液80ml混合即成，置瓶中备用。

（2）芦戈（Lugol）氏碘液

①碘1g;碘化钾2g；蒸锚水300ml

②先将碘化钾2g溶于100ml蒸储水中，再加碘1g,用力摇匀待溶解后加蒸储水至

300ml即成。供革兰染色媒染用。

（3）95%酒精

（4）石炭酸复红稀释液

1份碱性复红饱和液（碱性复红3.2克溶于95%酒精100ml中。即为碱性复红饱和溶液）

加9份5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸复红染液（抗酸染色用），取1份石炭酸复红染液

加9份蒸储水即为稀释复红染液。上述各种染液配成后，均需用滤纸过滤后使用，染液应贮

4

存于棕色瓶内。

'葡萄球菌、磕球菌.四联球菌

厂球菌V

L八登球菌、肺炎能球菌等

「枯草杆菌

「褥豆芽胞杆菌-

圣兰氏阳性葭L炭痕杆菌

「有:芽胞菌＜

「破伤风授菌

JI厌氧茂胞梭菌1产梭茵

、一杆菌L肉毒梭菌

、「白喉杆菌

无蒙腮菌J

1结核杆菌

「脑膜炎球菌

球苗1

-湘球菌

「大肠杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌

亚兰氏阴性茵通道杆菌1沙门氏的属：食物中毒沙门氏菌、

杆菌《1伤寒杆菌、副伤寒杆葭

肠道杆菌：百日咳杆菌、鼠疫杆菌

--餐乱及副隹乱孤葭

实验二细菌特殊结构的染色和观察

一、特殊结构

1.鞭毛：伤寒杆菌一一菌体较粗大杆状，染成蓝灰色，单个或成堆存在，周围可见到

波浪状弯曲、较长、呈蓝灰色的鞭毛。

2.荚膜：肺炎双球菌一一视野背景为红色，其中可见到染色呈深红色，矛头状菌体，

纵向成双排列，菌体周围有未染上颜色的空白区，即荚膜。

3.芽胞：破伤风梭菌一一菌体为细长杆状，顶端有染成蓝色、并大于菌体的球状物即

芽胞，呈“鼓槌状”，其它散乱分布的菌体，为菌体脱落的成熟芽胞。

二、细菌的芽胞染色

【目的】掌握细菌的芽胞染色法

【实验原理】细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能

使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一

旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着

色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，

芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽

胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。

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【材料】

1.材料培养的枯草杆菌（Bacillussubtilis）.

2.染色液和试剂5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液。

3.器材小试管、接种环、擦镜纸、镜子、显微镜等。

【方法】Schaeffer与Fulton氏染色法

1.涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。

2.晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2—3次。

3.染色：

①加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后用酒精灯火

焰加热玻片至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。加热过程中要随时添加染色液，

切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。

②水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。

③复染：用蕃红液染色5min。

4.水洗、晾干或吸干。

5.镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。。

【结果】芽胞呈绿色，菌体为红色。

三、细菌的荚膜染色

【目的】了解细菌的荚膜染色法

【原理】：由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设

法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量

在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免英膜皱缩变形。

【材料】

1.肺炎球菌

2.染色液和试剂：结晶紫、20%CuSC>4水溶液、香柏油、二甲苯。

3.器材：载玻片、玻片搁架，擦镜纸、显微镜等。

【方法】

1.制片：提前数日于小白鼠腹腔注射肺炎链球菌0.2ml,小鼠死亡后解剖，取腹腔液印

片。印片自然干燥，无需加热固定。

2.染色：

①滴加结晶紫染液，于火焰上加温染色，使冒蒸气，勿水洗。

②以20%CuSC>4溶液冲洗染液，勿水洗，干后镜检。

【结果】菌体呈现紫色，荚膜呈淡紫色。

四、细菌的鞭毛染色

【目的】了解细菌的鞭毛染色法

【实验原理】细菌的鞭毛极细，直径一般为10—20nm,只有用电子显微镜才能观察到。

但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到。鞭毛染色方法很多，但其基

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本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进

行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矶等配制而成。

【材料】假单细胞菌（Pseudomonassp.）斜面菌种。Leifson染色液、香柏油、二甲苯。

载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、镣子、接种环，显微镜。

【方法】

1.清洗玻片选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻

片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗

颗粒），煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5—6天，使用

前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸储水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。

2.菌液的制备及制片：在染色前将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白陈培养基斜面上（培

养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌

种放恒温箱中培养12—16除然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛

有1—2ml无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37℃恒温箱中静置lOmin（放

置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁

净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂

片放空气中自然干燥。

用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将0.304%的琼脂肉膏培养基熔

化后倒入无菌平皿中，待凝固后在平板中央点接活化了3-4代的细菌，恒温培养12-16h后，

取扩散菌落的边缘制作涂片。

3.Leifson染色法

①加染色液使染料覆盖涂片。

②水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸僧水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉

淀。

③干燥：自然干燥。

4.镜检先低倍观察，再高倍观察，最后用油镜观察，要多找一些视野，不要企图在1-2

个视野中就能看到细菌的鞭毛.

【结果】菌体和鞭毛均染成红色。

【注意事项】

1.Leifson染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，且染色液须经15-20次过滤，要

掌握好染色条件必须经过一些摸索。

2.染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。

3.细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心，以防鞭毛脱落。

五、细菌动力的观察

细菌不染色进行镜检，可观察细菌在自然生活状态下的大小、形态、活动等，但主要用

于观察细菌的动力。细菌不染色时呈无色半透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环

境的不同进行观察。细菌的动力是有鞭毛细菌的特征，因此观察细菌有无动力是鉴别细菌的

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依据之一。

（一）悬滴法

【原理】细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察

到鞭毛的形态、位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅需了解某菌是否有鞭毛，可采用

悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来

判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。

悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有

凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。水封片法是将菌液滴在普通的载玻

片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无

鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细菌鞭

毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。

【材料】

1.细菌：变形杆菌、葡萄球菌8~12小时肉汤培养物。

2.凹玻片，盖玻片，凡士林等。

【方法】

1.取凹玻片一张，于凹窝周围涂少许凡士林（图2-1）。

2.用接种环沾取变形杆菌或葡萄球菌8~12小时培养物，置于盖玻片中央。

3.反转凹玻片，使凹窝对准盖玻片中央，盖于其上，轻压后，迅速翻转玻片，使盖破

片面向上。

4.标本片置于显微镜载物台上，先用弱光线，低倍镜找物象，再改换高倍镜观察，密

切注意，勿压破盖玻片。因凹玻片较厚，油焦距很短，一般不用油镜观察。

图2-1

5.镜检观察：

先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中

央换高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低集光器以增大反差，便

于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动），前者在视野下可见

细菌自一处游动至他处，而后者仅在原处左右摆动。细菌的运动速度依菌种不同而异，应仔

细观察。细菌在镜下为灰色半透明体，并呈现真运动，如在明亮的海洋中，深入浅出游来动

去。

【结果】有鞭毛的枯草杆菌和假单胞菌可看到活跃的运动，而无鞭毛的金黄色葡萄球菌

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不运动。

【注意事项】

1.检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动。

2.制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大

量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。

【思考题】除了悬滴法外，还有什么方法可以鉴别细菌的动力

实验三细菌培养

一、常用培养基的制备

培养基给细菌提供适宜的生长条件，即细菌可以生长繁殖,形成具有一定特征的培养物。

培养基是用人工方法将适合细菌生长繁殖的各种营养物配制而成的营养基质，以供细菌培养

使用。一般培养基的主要成分为蛋白质、糖类、盐类、水分等。另外还有一些营养要求较高

的细菌，还必须加入血液或血清、鸡蛋、维生素等其它营养物质。有时为了鉴别或抑制某些

细菌，则可加入各种专用基质（如某种糖类、氨基酸等），指示剂，染料等。由于对培养基

的使用目的不同，故在培养基的选择上有所不同。按其物理性质可分为液体培养基、固体培

养基、半固体培养基。按其成分和用途可分为普通培养基、鉴别培养基、选择培养基和专用

培养基等。培养基需加入小试管、中试管、三角瓶、平皿等内使用。

培养基的种类很多，但一般制备原则有三条：

1.足够和适当的营养成分。籍以满足细菌生长繁殖的要求，获得典型细菌培养物，达

到研究细菌的形态，生化反应，抗原结构及致病力等方面的目的。

2.合适的酸碱度。培养基的酸碱度直接影响细菌的生长繁殖。一般细菌最合适PH为

7.2~7.6o测定的方法常用普通比色法或精密PH试纸来测定（见附录）。

3.绝对无菌。培养基务必进行除菌处理，由于培养基所含成分不同，灭菌的方法也不

同。如普通培养基常用高压蒸气灭菌法。

（-）普通肉汤培养基

【材料】

1.新鲜牛肉或牛肉膏，蛋白陈，氯化钠，琼脂，蒸储水。

2.酚红指示剂，比色架及标准比色管或精密PH试纸。

3.漏斗，量筒，三角烧瓶，试管等。

【方法】

1.称取去脂去腱绞碎的鲜牛肉500克，浸于1000ml蒸储水中，冰箱过夜，次日煮沸30分

钟，纱布过滤，蒸储水补足其量，（也可用牛肉膏3克加蒸储水1000ml加热溶化），即为肉

浸液。

2,取肉浸液1000ml,氯化钠5克，蛋白腺10克混合加热溶化。

3.调整PH为7.6,用滤纸过滤分装于中试管或三角烧瓶内，塞紧棉塞。

【用途】

供基础培养用，一般营养要求不高的菌均可生长。

（-）普通琼脂培养基

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琼脂是石花菜等海藻类提取的胶体物质，其化学成分主要是多糖。当温度达到98℃以上

可溶解于水，45℃以下则凝固。琼脂对细菌一般无营养作用（除自然界中极少数菌可利用琼

脂之外），纯属赋形剂。便于人们制做斜面、平板、高层等不同类型的固体培养基。

【材料与方法】

普通肉汤培养基100ml,加入琼脂2~3克，加热溶化，用蒸福水补足失去水分，调整PH

为7.6后分装于试管、平皿等器皿中，高压蒸气15磅灭菌20分钟，可制成普通琼脂斜面或普

通琼脂平板。

【用途】

供一般细菌培养用，并可作无糖基培养基。

（三）半固体培养基

【材料与方法】

取普通肉汤培养基100ml,加入琼脂0.5〜0.7克，加热溶化。调整PH为7.6,分装于小试

管内，每管1〜5ml,高压蒸气灭菌20分钟，待冷后放入4℃冰箱备用.

【用途】

保存一般菌种用，并可观察细菌的动力及生化反应。

（四）血液琼脂培养基

【材料与方法】

将高压灭菌后普通琼脂培养基。冷至45"C~500c时以无菌操作加入5%〜10%血液（人或

动物脱纤维无菌血液）。可制成血平板和血斜面。

【用途】

供营养要求较高的细菌分离培养用，亦可观察细菌的溶血特征。

（五）伊红美蓝琼脂（EMB琼脂）

【材料与方法】

蛋白陈10.0g,磷酸氢二钾2.0g,乳糖10.0g,伊红-Y0.4g,美蓝0.065g,琼脂15.0g,蒸

储水1000ml。

将以上各成分（伊红和美蓝除外）煮沸溶解于1000ml水中，调pH7.1±0.1。分别加入2%

伊红-Y水溶液20ml和0.65%美蓝水溶液10ml,于121℃灭菌15min。

【用途】

弱选择性平板培养基，主要用于大肠杆菌和产气肠杆菌的分离和鉴别

（六）SS琼脂

SS琼脂对大肠埃希菌有较强的抑制作用，而对肠道病原菌则无明显抑制作用。因此，

可以增加粪便标本的接种量，从而提高病原菌的检出率，故SS琼脂为目前比较满意的肠道

杆菌选择性培养基。

【材料与方法】

际蛋白陈5.0g,牛肉浸膏5.0g,乳糖10.0g,胆盐8.5〜10.0g,柠檬酸三钠8.5g,硫代硫

酸钠8.5g,柠檬酸铁1.0g,煌绿0.00033g,中性红0.025g,琼脂13.5g,蒸储水1000ml。

除中性红和煌绿外，其余成分混合于1000ml水中，煮沸溶解。调pH7.0〜7.2。然后加入

0.5%中性红水溶液4.5ml及0.1%煌绿水溶液0.33ml,摇匀，煮沸。待冷却至60℃倾入无菌平

皿。

【原理】

SS培养基中除含有基础培养基成分外，以中性红作为指示剂，变色范围pH6.8-8.0,在

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酸性时呈红色，在碱性时呈淡黄色。凡能分解乳糖的细菌，因为有酸类产生，能使指示剂变

红，所以菌落呈现红色；不分解乳糖的细菌，由于它分解蛋白腺产生碱性物质，所以菌落呈

淡黄色；能分解蛋白质产生H2S的细菌可与含铁化合物作用而使菌落带有黑色或形成黑心。

止匕外，培养基中含有煌绿，可抑制革兰氏阳性菌生长；胆盐与枸椽酸钠、硫代硫酸钠合

用，能加强对大肠杆菌的抑制作用；枸檬酸铁尚能中和煌绿、中性红等染料的毒性作用。

【用途】

分离沙门菌和志贺菌。大肠埃希菌分解乳糖产酸，通过中性红指示剂呈红色菌落，同时

由于与胆盐结合成胆酸发生沉淀，故菌落中心混浊。硫代硫酸钠有缓和胆盐对致病菌的有害

作用，并能中和煌绿和中性红染料的毒性。

（七）麦康凯琼脂（MAC）

【材料与方法】

蛋白腺20.0g,氯化钠5.0g,乳糖10.0g,胆盐5.0g,中性红0.3g,结晶紫0.001g,琼脂15.0g,

蒸储水1000ml。

将以上各成分（中性红与结晶紫除外）加热溶解于1000ml水中，调pH7.1±0.2。然后加

入0.1%结晶紫水溶液1ml和1%中性红水溶液3mL于121℃灭菌15min

【用途】

弱选择性平板培养基，主要用于分解乳糖的肠道致病菌。

【原理】胆盐能抑制部分革兰阳性菌及部分非病原菌的生长，但能促进某些革兰阴性病

原菌生长；因为含有乳糖及中性红指示剂，故分解乳糖的细菌，菌落呈红色（如大肠杆菌），

不分解乳糖的细菌，菌落不呈红色。

（A）双糖铁培养基（用成品制备）

【成分】

上层：蛋白陈1g下层：蛋白陈1g

乳糖1g葡萄糖0.2g

硫酸亚铁镂0.02g氯化钠0.5g

氯化钠0.5g酚红2mg

酚红2mg琼脂0.3g

琼脂1.Ig

【制法】（1）先称取下层粉末2克加入100ml蒸储水，放置数分钟后加热溶解，分装于

试管中，于8磅15分钟灭菌，取出后垂直凝固，待此下层培养基凝固后，再以无菌操作方

法加入上层培养基。

（2）称取上层粉末3.65克加入100ml蒸储水，放置数分钟后加热溶解装瓶，于8磅15

分钟灭菌后冷却至70℃左右，再以无菌操作加到凝固的下层培养基上面，立即制成斜面备

用。

【原理】培养基中除含有基础营养成分外，以酚红作指示剂（碱性时为红色，酸性时为

黄色），可鉴别细菌分解其中糖类及氨基酸的能力，凡能分解葡萄糖的，则使培养基底层变

黄，凡能分解乳糖的，则使斜面变黄；能分解糖类产生气体的，可使培养基断裂后出现气泡;

能分解含硫氨基酸的，可产生H2s与硫酸亚铁生成黑色化合物，使培养基显示黑色。

（九）疱肉培养基

【材料与方法】

牛肉浸液1000ml,蛋白豚30.0g,酵母膏5.0g,磷酸二氢钠5.0g,葡萄糖3.0g,可溶性淀

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粉2.0g,碎肉渣适量，pH7.8o

称取新鲜除脂肪和筋膜的碎牛肉500g,加蒸储水1000ml和lmol/L氢氧化钠溶液25ml,搅

拌煮沸15min,充分冷却，除去表层脂肪，澄清，过滤加水补足至1000ml。加入除碎肉渣外

各种成分，校正pH。碎肉渣经水洗后凉至半干，分装15mmXI50mm试管2〜3cm高，每管加还

原铁粉0.1〜0.2g或铁屑少许。将上述液体培养基分装至每管内超过肉渣表面约1cm。上面覆

盖溶化的凡士林或液体石蜡0.3〜0.4cm。⑵℃灭菌15min。

【用途】

用于肉毒梭菌的增菌培养。

（十）"Lowenstein-Jensen”培养基（罗氏培养基）

【材料与方法】

磷酸二氢钾0.96g,硫酸镁（MgSOUEO）0.048g,天门冬酰胺0.72g,甘油（中性）

2.4ml,枸椽酸镁0.12g,蒸储水120ml,马铃薯粉6.0g,新鲜鸡蛋6〜8只，1%孔雀绿溶液

8ml

1、将天门冬酰胺，磷酸二氢钾，枸椽酸镁及甘油加水后，置沸水浴中加热溶解。

2、加入马铃薯粉，继续在沸水浴中加热30分钟，时加搅拌，使成均匀糊状。

3、待冷至60℃,加入新鲜全蛋液200ml及1%孔雀绿8ml,充分搅匀后，用双层纱布

过滤。

4、分装于20XI50mm试管中，每管约8ml,塞紧，置成长斜面。

5、用85℃50分钟流通蒸气灭菌后，经37℃孵育48小时，证明无菌生长；冷置备用。

6、管内如无凝结水，可加无菌生理盐水0.5ml以防在贮存期中培养基干燥。

7、以无菌操作换上软木塞，置37℃培养48小时，无菌生长即可应用。

【用途】

主要用于分枝杆菌的分离培养。

（十一）巧克力色琼脂平板的制备

【材料】肉汤琼脂100ml无菌脱纤维羊或兔血10ml。

【方法】

（1）将肉汤琼脂加热溶化，趁热加入脱纤维血，摇匀。

（2）倾注平板，待冷却成巧克力色，备用。

【用途】用于培养脑膜炎双球菌或淋球菌。

【说明】加血一定要趁热加。

二、细菌培养接种技术

细菌培养技术可以纯化细菌，了解细菌的生长特征，进一步检测细菌生化反应、变异性,

制备细菌抗原，进行分子生物学工作等。了解细菌的培养特征也有助于鉴别细菌。

由于细菌感染而致病的各种标本及带菌者所需检查的各种标本，往往并非单一的细菌，

而且混有其它非致病菌（人体正常菌群）。因此当对此标本需作出细菌鉴定时.，就必须从标

本中分离出致病菌，称为细菌分离培养技术。另外，对已得到可疑病菌进行细菌鉴定及菌种

保存等培养，称为纯培养接种技术。

在微生物学实验中，无菌操作主要包括斜面接种、液体接种、平板接种、倒制平板和稀

释分离等。

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(-)平板划线接种法(又称分离培养法，图3-1)

平板分离划线的方法较多，其中以分区划线法与曲线划线法较为常用。其目的都要使细

菌呈现单个菌落生长，便于同杂菌菌落鉴别。现只介绍分区划线法。

【材料】

1.细菌：大肠杆菌、葡萄球菌18~24小时普通琼脂斜面培养物。

2.培养基：普通琼脂平板。

3.酒精灯，接种环等。

【方法】

用接种环挑取菌种后在平板上经分段划线分离，可得到纯种细菌。

图3-1平板划线法

图3-2几种划线方式示意图

图3-3平板划线法图34孵育后菌落的生长情况

①在酒精灯火焰上灼烧接种环，待冷却，取一接种环金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的混

合菌液。

②左手握住琼脂平板，用大拇指和食指稍抬起皿盖，同时靠近火焰周围，右手持接种

环伸入皿内，在平板上一个区域作“之”形来回划线。划线时使接种环与平板表面成30°〜

40。角轻轻接触，以腕力在表面作较快的滑动，勿使平板表面划破或嵌进培养基内。

③灼烧接种环，以杀灭接种环上剩余的菌液。待冷却后，再将平皿转动一定的角度，

13

接种环通过划过线的区域，在第二区域继续划线。

④划毕后再灼烧接种环，冷却后用同样的方法在其它区划线。

⑤全部划线完毕后，在平皿底注明菌种、组别、姓名和日期等。将培养皿倒置放入恒

温箱培养。

©适当温度培养一段时间后，取出观察。

（-）纯培养细菌接种法

1.斜面培养基接种法：用于培养，保存菌种及其它实验用。

【材料】

（1）大肠杆菌，葡萄球菌18〜24小时琼脂斜面培养物。

（2）普通琼脂斜面培养基。

（3）接种环，接种针，酒精灯等。

【方法】

图3-5斜面接种时的无菌操作

（1）接种环灭菌（2）开启棉塞（3）管口灭菌（4）挑起菌苔（5）接种（6）管口灭菌，盖好试

管塞

①操作前，先用75%乙醇擦手，待乙醇挥发后才能点燃酒精灯。

②将斜面菌种管和欲接种的斜面试管同时拿在左手的大拇指和其它四指之间，长有菌

苔的一面向上，并处于水平位置。

③先将菌种管和试管的棉塞旋松，便于接种时取出。

④右手拿接种环，与通常拿笔一样。将要伸入管内部分的金属柄和金属丝在酒精灯焰

上灼烧灭菌。

⑤用右手小指、无名指及手掌将菌种管和试管的棉塞同时拔出，并把棉塞握住，不要

随意放在桌上或与其它物品相接触，再以火焰烧管口。

⑥将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管内，接取菌种前先在管内壁上或未长苔

的培养基面上接触一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种。用接种环轻轻刮取少许苔后，

自菌种管内抽出。抽出时勿与管壁相碰，也勿再通过火焰。迅速将沾有菌种的接环伸入待接

种的斜面培养基试管内，由里到外划折线，使菌体粘附于培养基上。划线时，勿用力划破培

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养基。若以保存菌为目的时可自管底上划一粗直线即可。

⑦接种完毕后将接种环抽出，灼烧管口，塞上棉塞。加棉塞时，不要用试管口去迎塞,

以免试管在移动时污染杂菌。

⑧接种环在放回原位前，要经火焰灼烧灭菌。接种菌应作好标记，标明菌种名称，日

期等，置37℃温箱中培养，次日观察结果。

2.液体培养基接种法：用于增菌及鉴定细菌生长特点，如表面生长，沉淀生长，均匀

混浊生长等。

【材料与方法】

①由斜面菌种接入液体试管培养基：操作方法与前面的斜面接种相同，但应使液体管

口向上倾斜，以免培养液流出。接入菌体后，让接种环与管内壁轻轻研磨，使菌体从接种环

上脱落到溶液中。接种后塞好棉塞，将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。

②由液体培养基接种液体试管培养基：菌种如为液体时，接种除用接种环外，也可无

菌吸管或滴管。只需在火焰旁拔去棉塞，用无菌吸管吸取菌液后注入培养液内，摇匀即可。

置37℃温箱中培养，次日观察结果。

3.半固体培养基穿刺培养法

用于保存菌种及间接观察细菌之动力（无动力之细菌仅沿穿刺线生长，清晰可见；有动

力的细菌使培养基呈现混浊样，穿刺线甚至难以看出）。

用无菌操作技术，灭菌穿刺针沾取细菌后，垂直刺入半固体培养基中央直达近管底处，

再沿原穿刺线抽出即可，置37c温箱培养，次日观察结果。

【附注】

校正pH的方法为：

①取三支与标准比色管（pH7.6）相同的空比色管，其中一管内盛放蒸镯水5ml：另外两

管各加入欲测的肉汤培养基5ml,其中一管内加0.02%酚红指示剂0.25ml（滴定管），摇匀。

②按图3-6所示排列，举起比色架，对光观察。若滴定管色调较淡或为黄色，即表示

图3-6pH比色架

培养基偏酸性，需滴加O.lmol/LNaOH矫正；若呈深红色，即表示偏碱性，应滴加0.1mol/LHC1

矫正；使之与标准比色管色泽相同为止。通常未矫正前的肉汤均呈酸性。记下用去的NaOH

（或HC1）溶液量，由此计算出矫正全量培养基时所需NaOH（或HCI）溶液量。

实验四细菌的分布与无菌操作技术

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一、自然沉降法检查空气中的细菌

【材料】

普通琼脂平板。

【方法】

取普通琼脂平板一个，打开皿盖，让培养基直接暴露于空气中，置于实验台上或需要测定

的地方15〜30分钟。盖上皿盖，用记号笔或蜡笔注明放置地点、实验日期和实验者班级、姓名

等，放入37℃温箱培养18~24小时，观察细菌的生长情况和数量。并分析其意义。

二、倾注法检查水中的细菌

【材料与方法】

1.用无菌吸管吸取胜0.5ml水样加入肉汤培养基中。

2.另取一支未接种的肉汤管做对照，与上管一起置于37℃温箱培养18〜24小时，观察结果。

【结果】

对照管应透明清亮，试验管变混浊，说明水样中有活菌存在。并可通过比浊法估计细菌

生长繁殖后的数量。

三、人体体表及各种物品表面的细菌检查-拭子法和涂抹法

【材料】普通琼脂平板。

【方法】

取普通琼脂平板一个，在平板底面用记号笔或蜡笔将平板分成若干等份，于每份培养基表

面分别用手指、衣物、书本、笔等轻轻涂抹（不要擦破培养基）。也可用无菌生理盐水擦洗

衣物等，用无菌棉拭子涂于培养基表面，盖上皿盖，分别标记清楚。置37℃温箱培养18~24小

时观察结果。观察各种物品中细菌的数量及类别，并分析其意义。

【注意事项】

本实验检出的除细菌外，尚可能有真菌、放线菌等，请注意加以区别。

四、人咽喉部位的细菌检查

【材料】血液琼脂平板。

【方法】

1.咳碟法

取血液琼脂平板一个，打开皿盖，将培养基面置于口腔前约10厘米处，用力咳嗽数次（让

飞沫落在培养基表面），然后盖上皿盖，注明被检查者姓名、实验日期等。置37℃培养18~24

小时观察结果。观察细菌的数量、种类等，注意是否有溶血环，并分析其意义。

2.试子法

用无菌棉签涂取扁桃腺两旁的分泌物，在血琼脂平板表面涂布成线，然后改用接种环，作

分区划线接种，置37℃培养18~24小时观察结果。观察细菌的数量、种类等。注意是否有溶血

环，并分析其意义。

五、无菌操作技术

为了在研究某种微生物的过程中减少其它微生物的干扰和影响，必须为所研究的微生物

提供一个无其它杂菌的环境，创建这一环境的技术即为无菌技术。

在实施无菌技术中，须牢记自然环境中微生物是无处不在的，从而在无菌操作中形成必

要的“无菌概念”。所有无菌实验操作都是建立在此观念上。

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实验五消毒灭菌

采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称

之为灭菌(sterilization)。消毒(disinfection)则是用较温和的物理或化学法杀死物体上绝大多数

微生物(主要是病原微生物和有害微生物的营养细胞)，实际上是部分灭菌。

在微生物实验、生产和科学研究工作中，需要进行细胞、微生物纯培养，不能有任何

外来杂菌。因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作

顺利进行。实验室最常用的灭菌方法是高温灭菌，主要使微生物的蛋白质和核酸等重要生物

大分子发生变性。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。湿热灭菌的效果比干热灭菌好。

这是因为湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变

性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺

少的常用方法。

【常用灭菌技术和分类】

1.干热灭菌

干热灭菌包括火焰灭菌和干燥热空气灭菌。

微生物接种工具如接种环、接种针或其它金属用具等，可直接在酒精灯火焰上灼烧进行

灭菌。这种方法灭菌迅速彻底。此外，接种过程中，试管或三角瓶口等，也可通过火焰灼烧

灭菌。

用干燥热空气杀死微生物的方法称为干热灭菌。通常将灭菌物品用锡箔纸包裹好或放入

灭菌专用的铁盒(或铝盒)内，置于鼓风干燥箱内，在160℃〜170℃加热1〜2h。灭菌时间可

根据灭菌物品性质与体积作适当调整，以达到灭菌目的。玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金

属用具等凡不适于用其它方法灭菌而又能耐高温的物品都可用此法灭菌。

2.湿热灭菌

湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌，在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：

①热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构

的氢键和其它相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比；

②热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；

③蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温

度。

多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理15min后即可杀死，真菌的范I子要耐热些,

要用80℃以上的温度处理才能杀死，而细菌的芽胞更耐热，一般要在120℃下处理15min

才能杀死。

根据灭菌时压力大小可以分为常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌。常压蒸汽灭菌在不能密闭

的容器里产生蒸汽进行灭菌。所用的灭菌器有阿诺氏(Aruokd)灭菌器或特制的蒸锅，也可用

普通的蒸笼。常压蒸汽灭菌比较有代表性的是巴氏消毒法和间歇灭菌法。巴氏消毒法是用于

牛奶等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中的无芽胞病原菌，

而又不影响其特有风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各有不同，

一般在85c下保持5min即可。间歇灭菌法又称分段灭菌法，适用于不耐热培养基的灭菌，

17

方法是将待灭菌的培养基在100℃下蒸煮30〜60min,以杀死其中所有微生物的营养细胞，

然后置室温或20〜30℃下保温过夜，诱导残留的芽胞萌发，第二天再以同法蒸煮和保温过

夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。

高压蒸汽灭菌将水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会

使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。为达到灭菌效果，一般要求

温度达到121℃（压力为O.IMPa）,维持15〜30min。也可采用在较低的温度（115℃,即

0.075MPa）下维持35min的方法。蒸汽压力与温度的关系表5-1中所示。

表5-1蒸汽压力与温度的关系

蒸汽压力（表压）蒸汽温度

Kg/cm2MPa℃°F

0.0()0.00100212

0.250.025107.0224

0.500.050112.0234

0.750.075115.5240

1.000.100121.0250

1.500.150128.0262

2.000.200134.5274

在使用

高压蒸汽灭菌器进行灭菌时，蒸汽灭菌器内冷空气的排除是否完全极重要，因为空气的膨胀

压大于水蒸汽的膨胀压。所以当水蒸汽中含有空气时，压力表所表示的压力是水蒸气压力和

部分空气压力的总和，不是水蒸气的实际压力.它所相当的温度与高压灭菌锅内的温度是不

一致的。这是因为在同一压力下的实际温度，含空气的蒸汽低于饱和蒸汽。见表5-2所示•

表5-2空气排除程度与温度的关系

压力表读数灭菌器内温度/℃

/Pa未排除空气排除1/3空气排除1/2空气排除2/3空气完全排除气

35729010994100

7090100115105109

105100109121112115

140109115126118121

175115121130124126

210121126128130135

由上表看出：灭菌锅中的空气排除不干净，达不到灭菌所需的实际温度。因此，必须将

灭菌器内的冷空气完全排除，才能达到完全灭菌的目的。在空气完全排除的情况下，一般培

养基只需在O.IMPa下灭菌30min即可。但对某些物体较大或蒸汽不易穿透的灭菌物品，如

固体曲料、土壤和草炭等，则应适当延长灭菌时间，或将蒸汽压力升到0.15MPa保持1〜2h。

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【附注】

1.手提式压力蒸汽灭菌消毒器使用方法

⑴堆放消毒的物品应予以妥善包扎，各包之间留有间隙堆放在消毒桶的筛板上。这

样可有利于蒸汽的穿透，提高灭菌效果。

⑵在主体内加入清水至4升，使水位一定要超过电热管，连续使用时，必须在每次消

毒前补足上述水量，以免因缺水而不能正常工作。

⑶将堆好物品的消毒桶放在主体内。然后把盖上的放气软管插入消毒桶内侧的圆槽内。

对正盖与主体的螺栓槽，顺序地将相对方位的翼形螺母予以均匀旋紧，使盖与主体密合。

（4）将消毒器接上与铭牌标志电压一致的电源，插上电源插座电热管通电开始工作。在

加热开始时，应将放阀的摘子堆至垂直放气方位，使冷空气随着加热由桶内逸去。等有较急

的蒸汽喷出时，即将该摘子板回水平“关闭”方位。此时压力表指针应加热而随

着逐渐上升，指示出消毒器的压力和温度。

⑸当压力到达所需的范围时，开始计算消毒所需时间，并使之维持恒压当达到0.14兆

帕124-126摄氏度消毒时，则安全阀能使之维持恒压。

（6）对物品在消毒后要迅速干燥，可在消毒终了时将消毒器内的蒸汽通过放气阀予以迅

速排出，待压力表指针回复至零位，使物品上残留水蒸汽得到蒸发，随着将电源切断停止加

热，（消毒液体时严禁使用干燥方法。）

⑺消毒结束时，必须先将电源切断，停止加热待其冷却，直至压力表指针回复位至零

位，再待数分钟后排去余气后，才能将盖开启。

图5-1手提式压力蒸汽灭菌锅图5-2LDZX-30FBS型自动型高压蒸汽灭菌锅

2.LDZX-30FBS型自动型高压蒸汽灭菌锅

1）自动型高压蒸汽灭菌锅特点，见图5-2

①电脑控制自动循环灭菌程序

②数码窗液晶显示工作状态

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③温度任意设定（50°C-126℃）

④时间任意设定（0-99小时）

⑤超压自泄0.145-0.165Mpa

⑥灭菌终了蜂鸣器提醒后自动停机

⑦操作简便、安全可靠

2）自动型高压蒸汽灭菌锅使用方法

①水箱内加入定量水，放入待灭菌物品。

②关上灭菌锅盖，将固定螺杆旋紧。

③打开电源开关，指示灯亮。

④设定灭菌温度、温度，启动灭菌程序。

⑤灭菌完时蜂鸣器提醒后自动停机。

3.洁净工作台使用方法

图5-3SW-CJ-1C型洁净工作台

图5-4VS-1300-U型洁净工作台

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(1)使用前应提前开机，打开紫外灯和风机开关15〜20分钟.

(2)新安装的或长期未使用的净化工作台，使用前必须对净化工作台和周围环境用超净

真空吸尘器或不产生纤维的工具认真进行清洁工作。

(3)工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰。

(4)禁止在工作台面上记录，工作时应尽量避免作明显扰乱气流的动作。

(5)定期(一般每二月一次)，用热球式电风速计测量工作区风速，如发现不符合技术

参数的要求，则可调大风机供电电压。

(6)经常注意工作台上压差表的指针，当指针从绿色区进入红色区时，说明此高效空气

过滤器的容尘量已饱和，应调大风机电压，须再用风速计测量工作区风速，当平均风速

<0.3m/s时，应予以更换。

【注意事项】

1)干热灭菌时：

(1)灭菌的玻璃器皿切不可有水，有水的玻璃器皿在干热灭菌中容易炸裂。

(2)灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响