单细胞实验技术

、单细胞裂解（3h）1、 UP1引物定容到0.5um：1ul的UP1引物（100um）加入199ul去核酸酶H2O中，用小管盛装，并充分混匀；（所有的引物序列都列在表1）2、 准备细胞裂解液（4.45ul每个样品），使用0.5ml薄壁PCR管，加入并混匀以下组分：组分最终浓度体积(ul)(1X)体积(ul)(6X)10XPCRbufferII(无MgCl2)0.9X0.45625mMMgCl21.35mM0.27—10%NP400.45%0.2251.350.1MDTT4.5mM0.2251.35SUPERase-In(20Uul-1)0.18Uul-10.045—RNaseinhibitor(40Uul-1)0.36Uul-10.0450.540.5uMUP1引物12.5nM0.1250.75dNTPmix(2.5mMeach)0.045mM(each)0.090.54Nuclease-freewater—2.97516.17总体积—4.4526.7注意：NP40有毒；3、 从输卵管获得四细胞时期胚胎，用口吸管转移到一滴台氏液（acidicTyrode’ssolution），以去除透明带；关键步骤：在所有转移步骤中，在转移一个单细胞到裂解液前，需保证使用吸管时没有形成气泡。4、 将胚胎转移到无钙离子培养液中，轻轻吸动知道单个卵裂球分离出来；5、 随后将卵裂球转移到三个PBS-BSA液滴中（50-100ul），洗涤。6、 单个细胞被转移到含有4.45ul新鲜准备的细胞裂解液中（用0.5ml薄壁PCR管）。先吸一小段PBS-BSA，再吸细胞，然后全部打入裂解液中。关键步骤：每个吸管只能用一次，不能重复利用，不能多次用于转移别的细胞到裂解液中。关键步骤：应该有一个隐形对照样品，即没有细胞加入。7、 样品短暂离心：7500g，30s，4°C。然后立刻放置于冰上。8、 70C孵育90s，马上转移到冰上；9、 7500g，30s，4C，然后立刻转移到冰上1min。这个步骤之后，所有的mRNAs将从单细胞中释放。二、反转录（2h）10、加入0.45ulRTmix（如下表）到每一个管中，从而每个RT反应的体积达到5ul每管:4.45ul裂解液，约0.1ul吸胚胎时带出的PBS-BSA，以及0.45ulRTmix。组分终浓度（Uul-1）1X体积(ul)6X体积(ul)SuperScriptIIIreversetranscriptase(200Uul-1)13.20.331.98RNaseinhibitor(40Uul-1)0.40.050.3T4gene32protein(1-10Uul-1)0.07U0.070.42总体积—0.452.711、 50C孵育30min；12、 逆转录酶失活，70C，15min；13、 离心7500g，4C,30s，然后立刻转移到冰上1min。这个步骤后，所有的mRNAs的第一

条链cDNAs合成。三、自由引物去除（2h）14、准备核酸外切酶I并混匀并混合以下组分，每一个反应加入1.0ul混合物;组分终浓度1X体积（ul）5X体积（ul）10XExonucleaseIbuffer1X0.10.5Nuclease-freewater—0.84ExonucleaseI(5Uul-1)0.5Uul-10.10.5总体积—1515、 37°C孵育30min；16、 核酸外切酶失活：80C,25min；17、 离心7500g,4C,30s，然后马上转移到冰上1min。此步后，所有自由UP1引物被破坏，只保留了完整的5‘cDNA末端；四、3’Poly（A）加尾18、准备TdT反应混合物，如下表。每个反应加入6.0ul混合物;组分终浓度1X体积（ul）6X体积（ul）10XPCRbufferII(withoutMgCl2)1X0.63.625mMMgCl21.5mM0.362.16100mMdATP3mM0.181.08Nuclease-freewater—3.6621.96Terminaltransferase(5Uul-1)0.75Uul-10.95.4RNaseII(2Uul-1)0.1Uul-10.31.8总体积—63619、 37C孵育15min；20、 TdT失活：70C，10min；21、 离心7500g，4C,30s，然后马上转移到冰上1min。此步后，第一链cDNAs3'末端加入了poly（A）尾；五、第二链合成（1h）22、准备76ulPCRmix1，组分如下表:组分终浓度1X体积(ul)80ul体积10XExTaqbuffer(withMgCl2)1X7.68.0dNTPmix(2.5mMeach)0.25mM7.68.0UP2primer(100um)1um0.760.80Nuclease-freewater—59.2862.40TakaraExTaqHS(5UuH)0.05Uul-10.760.80总体积—768023、 将poly（dA）tailedRT产物分到四个空的0.2ml薄壁PCR管中（3ul每管）;24、 每管中加入19ulPCRmix1；25、 PCR扩增：95°C,3min；50°C,2min；72°C,10min；26、 冰浴1min；27、 离心7500g,4C,30s,然后马上转移到冰上。此步后，第二条链cDNAs为5’-UP2-（T）-UP1-3’；n六、PCR扩增28、准备76ulPCRmix2,组分如下表:组分终浓度1X体积(ul)80ul体积10XExTaqbuffer(withMgCl2)1X7.68.0dNTPmix(2.5mMeach)0.25mM7.68.0100umUP1primer1um0.760.80Nuclease-freewater—59.2862.40TakaraExTaqHS(5UuH)0.05Uul-10.760.80总体积—768029、 每管中加入19ulPCRmix2；30、 PCR扩增：首先95C,3min；然后二十个循环：95C,30s；67C,1min；72C,6min（每一个循环增加6s）；4C,保存。此步后，所有的cDNAs已经得到扩增。将PCR产物储存在-80C（可保存6个月）；或者转移到冰上，如果立刻继续进行第31^步。七、DNA纯化31、 混匀每一管中的PCR产物；32、 取10ul混匀后的PCR产物，加入90ulnuclease-freewater，以稀释10倍。取1ul或2ul这些稀释后的PCR产物作为模