主稿空气微生物检测培训教材

<公共场所集中空调通风系统卫生规范>

<公共场所集中空调通风系统卫生学评价规范>

卫生微生物学目的与检测方法

中国疾病预防控制中心环境与安康相关产品平安所王俊起

范围

<公共场所集中空调通风系统卫生规范>

涉及到卫生微生物目的的条款包括：1、嗜肺军团菌〔集中空调通风系统冷却水和冷凝水〕2、细菌总数≦500cfu/m3真菌总数≦500cfu/m3β－溶血性链球菌等致病性微生物〔集中空调通风系统送风〕3、细菌总数≦100cfu/cm2真菌总数≦100cfu/cm2致病微生物〔集中空调通风系统风管内外表〕集中空调通风系统送风嗜肺军团菌的检测〔——液体采样法〕目的控制由于空调通风系统呵斥生物致病因子经空气播散；预防危害人体安康，疾病传播的公共卫生问题发生；规范现场与实验室操作，为监视执法、预警预告提供准确的数据。预备与现场采样1、采样设备、器材、试剂与培育基预备2、现场调研、现场记录3、采样人员无菌操作与个人防护4、采样点的选择5、采样无菌操作6、气溶胶样品的采集〔六级采样器〕7、水样品的采集8、尘样品的采集9、样品采集后的现场整理10、样品采集过程中，人员的普通平安防护•

Inadequateventilation（通风不当）52%•

Contaminationfrominsidebuilding（建筑物内部污染）16%•

Contaminationfromoutsidebuilding（建筑物外部污染）10%•

Microbialcontamination(微生物污染）

5%•

Contaminationfrombuildingfabric（纺织品的污染）

4%•

Unknownsources（来源不明）13%影响室内环境〔1、2、3、4、5〕

微生物污染的要素空调系统调查结果〔援用〕新风量大室内空气质量高新设备运转时空气质量优于老设备清洁设备运转时空气质量优于污染设备检测生物性污染物对空调系统的污染与对室内空气质量的影响具有卫生学意义。空调系统的卫生微生物学检测不能够摆脱室内空气污染的规律与概念。认识1、室内污染来源占的份额高于室外。2、上述要素与空调系统均相关；但并不是说空调设备本身呵斥了室内空气污染；其危险与潜在的危害，是由于空调通风系统把人类的活动〔任务、生活、喜好与环境等〕呵斥的空气质量形状，进展了保送、转移、传播。空调给于了微生物一定的生存条件。3、空调系统的生物性污染除嗜肺军团菌外还有许多成员。如：目前国外有关室内空气真菌、空调系统所致真菌污染方面的研讨日渐增多。4、环境对室内空气微生物存在极大影响〔记录重要〕。5、我们现行的规范要求包括了我们目前遇到的、能够遇到的生物性致病因子。指示生物与目的菌微生物在空气中的传播名词解释：气溶胶〔aerosol〕：是固态或液态微粒悬浮在气体介质中的分散体系。其微粒为微生物时，称之为微生物气溶胶。液态粒子称雾；小于1µm的固态粒子称烟；大于1µm的粒子称尘。名词解释气溶胶粒子大小：气溶胶粒子大小分布从0.001~100µm微生物气溶胶粒子大小，从0.002~30µm。致病性生物因子凡是在室内空气环境存在的致病性生物因子，都有能够经过空调系统播散，以致能够由于污染环境给人带来危险或潜在的危害。室内空气环境存在的致病性生物因子主要有如下几类室内空气环境存在的致病性生物因子：空气带菌粒子危害部位1、1~5的空气带菌粒子可直接侵入肺泡2、6~10的空气带菌粒子易冷静在小支气管3、10~30的空气带菌粒子会堆积在支气管微生物与粒子1、空气中与疾病有关的带菌粒子直径普通为4~20µm。2、来自人体的微生物主要附着在12~15µm的尘粒上。3、许多真菌以单个孢子的方式存在。微生物1、细菌类：结核杆菌、非结核杆菌、肺炎双球菌、嗜肺军团杆菌等160余种。2、真菌类：球孢子菌、假丝酵母〔念珠菌〕、曲霉、毛霉、青霉等600余种。3、病毒类：流感、水痘、风疹、腺病毒等约几百种。4、其他：支原体、衣原体等。相关要素空气中的微生物的存在和生存时间〔存活力viability〕与水环境、土壤环境的情况严密相关，微生物本身的特征起主导作用。研讨微生物的生境是重要的任务内容。特点根据实验研讨，空气中的微生物假设不能回到有利于其生活和繁衍的环境中，迟早是要死亡的。微生物几乎全部是附着在尘埃上，尘埃并不全部有微生物的附着；灰尘量与菌数并不呈现线性正相关。不同的采样方法所捕获的带菌粒子也不一样。趋势强毒力、高传染性微生物气溶胶的研讨兔热杆菌：志愿者15个左右的菌即可；军团菌：气溶胶中检出即对人有感染。日本乙型脑炎病毒、裂谷热病毒、拉沙热病毒、出血热病毒、与畜牧业新城疫、流感等。真菌、真菌毒素。方法学中的问题1、空调系统与室内空气质量的相关性2、不同的采样方法所获得的结果有差别3、样品处置方式、操作不一致影响结果的一致性4、留意样品处置过程的一致性

指示生物的选择肠道指示生物为例〔N条〕：肠道独有，代表性强数量多存活时间比致病菌稍长对消毒剂的耐受性比致病菌稍高对人危害无或很小检测方便，程序简单指示生物大肠杆菌作为水污染与否的卫生指示生物运用多年，行之有效，各界公认，根本符合指示生物的多项要求。对于室内空气而言，指示生物那么难以被选出。大肠杆菌作为粪便污染的指示生物，与肠道传染病的病原体不仅同原，还存在诸多共性，有代表性。空气那么无法找到这么一个指示生物。所以对空气质量的认同，我们选择了指示生物与致病生物监测两个途径。指示生物的目前选择细菌总数、真菌总数、溶血性链球菌、嗜肺军团杆菌等等检测方法的论述

采样样品保管与运输1、带培育基的样品2、普通水、土样品3、分别军团菌的样品4、培育基的运输与保管〔时间、温度、避光〕〔防污染、防增殖、防消亡、防破损、防乱号〕本卷须知1、采样：气体：〔以时间确定〕仪器法。尘量：适时评价确定方法〔擦拭、刮拭〕。2、培育基检查有无污染3、培育时间相关的问题〔菌数多少、湿度保证、温度控制〕4、采样点的选择5、关注采样环境采样与检测方法1、对室内空气常用的采样方法有：自然沉降法〔曝皿法〕〔本稿不采用〕空气微生物采样器法：引荐撞击式6级空气微生物采样器2、液体过滤、冲击采样：采集室内空气军团菌时运用3、管道：擦拭法、刮拭法采样——人工擦〔棉〕拭法：布、棉花或其他资料，通常用灭菌盐水润湿，经过擦拭采取通风管道外表的微生物；然后在同样的溶液洗脱微生物，并涂平板培育与计数菌落构成单位以供分析，涂板方法可用湿拭子直接涂布，也可以用洗脱液涂布。在无法进展机械采样的风管中运用。刮拭法：尘量多、板结、粘稠时运用采样——机器人人工采样遭到多方面的影响，一致性不高，难完成规范要求的义务；机器人采样同一性高；能满足规范要求的任务内容；目前种类较少，通风管道没有标化：符合规范要求按产品阐明书的要求操作留意质控采样与检测方法直接的灰尘培育：从空调通风管道外表获得灰尘，直接悬浮于0.01%吐温80〔PBS或生理盐水〕溶液中，然后稀释并选择适宜稀释度，取1mL按倾注法操作，培育与计数菌落构成单位以供分析。尘量大需求秤量。

检测方法的论述

细菌总数细菌总数细菌总数定义：仪器法采集室内空气，计数在营养琼脂培育基上经37℃48小时培育所构成的菌落数，换算为每立方米室内空气中菌落总数，以cfu/m3〔colonyformingunits/m3〕每立方米室内空气菌落构成单位报告。管道尘的稀释倾注法：检测管道尘中的细菌总数依Xcfu/cm2报告。细菌总数的检测细菌总数的检测细菌总数的检测细菌总数的卫生学意义空气没有提供作为细菌和它种微生物生长所需求足够的水分与营养物质，所以空气不是微生物产生与繁衍的场所，检测出空气中存在微生物，主要来源于外环境〔包括植物在内〕与人、动物的活动。某一种或几种致病性微生物存在的内在缘由，即是人、畜污染所致，致病微生物的存在，对生活之中的人们就能够构成了潜在的危险，在条件适宜的情况下呵斥疾病的传播。普通说，室内空气质量在适宜微生物贮留与生长繁衍的场所，与换气量缺乏、通风不良、人员较多时，就呵斥微生物数量的添加。虽然单纯微生物种类与数量的多寡，不能说就一定引起人们的疾病，却可以有不温馨的觉得。室内空气规范制定的情况苏联：规定夏季清洁空气为细菌总数＜1500cfu/m3、污染空气为细菌总数＞2500cfu/m3；而冬季清洁空气细菌总数＜4500cfu/m3、污染空气为细菌总数＞7000cfu/m3。室内空气规范制定的情况日本：日本采用自然沉降法一致用直径9cm平皿:将室内空气分为5级：清洁＜29、普通30－74、可接纳界限75－149、轻污染150－299、重污染＞300。室内空气规范制定的情况我国：医院：撞击法＜2500cfu/m3沉降法＜30cfu/皿。公共场所撞击法<4000cfu/m3；沉降法<45cfu/皿。香港特别行政区〔制定“办公室及公众场所室内空气质素管理指引〞，指明微生物污染物包括三大类，细菌、真菌、过滤性病毒。〕空气中细菌规范是，一类＜500cfu/m3，二类＜1000cfu/m3。空调通风管道外表细菌浓度在空调通风管道外表细菌浓度，在3.2×105～1.5×106cfu/g之间。普通情况下，微生物浓度添加的一些因子包括潮湿条件与空气回流。在空调通风管道外表细菌污染普通情况下低于旋转热交换器〔107cfu/m2〕、冷却管或加湿器〔107cfu/m2〕。有资料阐明，灰尘外表浓度对可生存的微生物浓度影响小，堆积于空调通风管道外表后再构成生物气溶胶的菌存活时间普通较短，有待于更多的实验与检测数据证明。室内空气规范制定的情况实验资料：人群聚集80min空气中细菌数，沉降法44cfu/皿，撞击法4300cfu/m3。在撞击法细菌总数4000cfu/m3，沉降法33cfu/皿，CO20.08％浓度时，有异臭感和不适感者为24.1％；在撞击法细菌总数6000cfu/m3，沉降法75cfu/皿，CO20.15％浓度时，有异臭感和不适感者出现率为55％。采样方法与要求采样时必需在空调系统正常运转条件下，封锁门窗〔参考时间30分钟〕，尽量减少人、畜的活动幅度与频率，记录采样位置、室内人员数量、温湿度与天气情况等。采样方法与要求采样运用营养琼脂培育基，37±2℃培育48±4小时，观查并记录结果〔37℃培育24h时应进展观查，不用记录结果〕。采样方法与样品处置要求空调系统管道：无菌操作准确称取管道尘〔记录数量〕，参与到含有0.01%Tween-80的0.03mol/LPBS中，作10倍梯级稀释，视灰尘含菌量多少选三个数量级的稀释液，各取1mL稀释液直接参与平皿中，用营养琼脂培育基作混碟培育。37±2℃培育48±4小时，观查并记录结果〔37℃培育24h时应进展观查，不用记录结果〕，其所得菌落数乘以稀释倍数，换算cfu/cm2细菌总数。采样方法与要求空调送风：依监测目的和运用方法确定采样点，选择仪器法采样普通在送风口下方15～20cm间隔50～100cm处；室内空气：采样点的高度为1.2m。不同采样方法所获得的结果不一致，报告结果时应注明采样方法。培育基的制备成分：蛋白胨10g氯化钠5g肉膏5g琼脂20g蒸馏水1,000ml制法：将上述成分加热溶化于蒸馏水中，校正pH值为7.4~7.6。参与琼脂，121℃20min灭菌。用途：供空气细菌总数检测用。含0.01%Tween-80的0.03mol/LPBS磷酸氢二钠2.83g磷酸二氢钾1.36g蒸馏水至990mLTween-80最终浓度0.01%方法：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾溶于少量蒸馏水中，溶解混匀加水至990mL，按比例参与1%Tween-80液10mL，使最终浓度0.01%，121℃蒸汽灭菌20min。留意点1、采尘样条要浸泡在转运液体中。2、稀释与取样时充分洗脱，操作一致3、进口安德森采样器的运用：留意平皿中琼脂的厚度检测方法的论述真菌总数：仪器法采集室内空气，计数在沙氏琼脂培育基上经28±2℃培育5天培育所构成的菌落数，换算为每立方米室内空气中菌落总数，以cfu/m3〔colonyformingunits/m3〕每立方米室内空气菌落构成单位报告。管道尘的稀释倾注法：检测管道尘中的真菌总数依Xcfu/cm2报告。空调系统与真菌病病态建筑综合症的典型病症包括：眼刺激，鼻刺激和鼻充血，咽刺激和咳嗽、呼吸困难、嘶哑、皮肤刺激、头痛、呕吐、疲劳、精神疲惫和对味的感知问题等。确定引起上述病症的缘由很难。性别、社会心思要素、从事的职业等客观要素影响作用虽小，却难断然排除。真菌总数的规范情况我国目前的卫生规范尚无对真菌总数的详细要求，但是该目的遭到国际社会日益关注。在某些居室建筑、办公场所中真菌总数每立方米可达数百至千，在有霉变气味的室内真菌总数那么更高。污染真菌绝大多数是在土壤中或其他基物上生长、繁衍，真菌孢子体积小、质量轻、数量大，易随气流的运动而被传播，故有“气菌〞之称。相关性空气中真菌的含量有明显的季节性，与温度、湿度、地理位置等要素亲密相关。巴黎6月时空气中真菌浓度n×104/m3，冬季那么仅为100/m3；国内某坑道的监测显示空气湿度添加真菌数也添加，为此我们对南北方以维持高湿度天气的长短，分别给予了不同的要求；室内铺有地毯的普通比没有铺地毯的真菌数高；人的活动、清扫卫生、换衣铺床等空气中的真菌数添加。相关规范WHO的要求：<150cfu/m3〔采样方法：离心式采样器〕；芬兰：<200cfu/m3〔采样方法：Anderson采样器〕；美国：<1,000cfu/m3〔采样方法：未阐明〕规范值根据与参考数值我国目前的卫生规范尚无对真菌总数的详细要求，但是该目的遭到国际社会日益关注。在某些居室建筑、办公场所中真菌总数每立方米可达数百至千，在有霉变气味的室内真菌总数那么更高。采样方法与要求空调送风：依监测目的和运用方法确定采样点，选择仪器法采样普通在送风口下方15～20cm间隔50～100cm处；室内空气采样点的高度为1.2m。报告结果时应注明采样方法。管道尘：机器人采样与刮拭法采样采样方法与要求采样时必需在空调系统正常运转条件下，封锁门窗〔参考时间30分钟〕，尽量减少人、畜的活动幅度与频率，记录采样位置、室内装修情况〔织物包厢、地毯铺置、花草养殖〕与人员数量、温湿度与天气情况等。培育要求运用沙氏琼脂培育基，28±2℃培育5～7d，需逐日观查并及时记录结果〔如培育至5日时，霉菌或放线菌的菌丝生长掩盖周围菌落或菌丝长至满皿，可停顿观查并记录结果，但在报告时需注明〕采样方法与要求空调系统管道尘：无菌操作准确称取管道尘，参与到含有0.01%Tween-80的自来水中，作10倍梯级稀释，视灰尘含菌量多少选三个数量级的稀释液，各取0.3mL稀释液直接涂沙氏琼脂培育基平皿，28±2℃培育，其所得菌落数乘以稀释倍数，换算成cfu/cm2真菌总数。培育基的制备1、沙氏〔Sabourand’sagar〕琼脂培育基：成分：蛋白胨10g葡萄糖40g琼脂20g蒸馏水1,000ml制法：将蛋白胨、葡萄糖溶解于蒸馏水中，校正pH值为5.5～6.0，参与琼脂，115℃15min灭菌备用。用途：供空气真菌总数检测用。说明此培育基是国际上培育真菌的规范培育基，运用广泛。培育基的pH值为5.5～6.0，除真菌外普通菌不易在此酸性培育基中生长，在配制时普通不需调整pH，其值即与此接近。琼脂在酸性条件下多次加热，降低或丧失琼脂的凝固性，需留意。为抑制细菌与放线菌的生长，可在1L沙氏琼脂培育基中参与40~50mg氯霉素和500mg放线菌酮，两种抗菌素均耐热，在高压蒸汽灭菌前参与。含0.01%Tween-80的自来水稀释液与自来水中参与Tween-80，使最终浓度为0.01%，121℃20min灭菌备用。检测方法的论述β－溶血性链球菌β－溶血性链球菌〔HS〕溶血性链球菌〔HS〕定义：经35～37℃，24～48小时培育，在血平皿平板上构成呈灰白色，外表突起直径0.5~0.7mm的细小菌落，菌落透明或半透明，外表光滑有乳光；镜检为革蓝氏阳性无芽孢球菌，圆形或卵圆形，呈链状陈列〔视培育与操作条件影响链可短可长4~8个细胞至几十个细胞〕；菌落周围有明显的2～4mm界限清楚、完全透明的无色溶血环。符合上述特征的菌量称为溶血性链球菌。以cfu/m3〔colonyformingunits/m3〕每立方米室内空气菌落构成单位报告。β－溶血性链球菌〔HS〕

溶血性链球菌的卫生学意义溶血性链球菌与细菌总数的相关性：溶血性链球菌与细菌总数并没有相关性，陶晓燕在空调环境中三家证券买卖所的调查报告结果显示，在细菌总数并没有显示严重污染时，溶血性链球菌的数量阐明空气污染的程度已很严重。溶血性链球菌的卫生学意义因此确认空调覆盖面积大小〔换气量大小〕与人员数量的关系亲密，人员添加必定会使致病性污染的几率添加。另外链球菌是一个大家族，包括6个群30个种，其成员可以在水、乳品、家禽、肉。蛋中曾经分别出多种链球菌，