第十三章临床微生物标本细菌学检测

第十三章临床微生物标本细菌学检测第一节血液及骨髓标本细菌学检测一、采集指征1．怀疑菌血症、真菌菌血症、败血症、脑膜炎、骨髓炎、关节炎、肺炎、感染性心内膜炎及不明病原发热等情况下均应在未进行系统性抗菌药物治疗前，及时进行血液培养，患者出现以下症状、体征时可作为采集血培养的重要指征。寒战伴发热(≥38℃)或低温(≤36白细胞增多(＞10×109/L)，特别有“核左移”未成熟的或带状的白细胞增多；粒细胞减少(成熟的多核白细胞＜1×109/L)；血小板减少，皮肤黏膜出血；昏迷，多器官功能衰竭；或同时具备上述几种体征时应采血培养。2．新生儿怀疑菌血症时，还须同时做尿液和脑脊液培养。3．老年菌血症患者可能不发热或不低温，如伴有身体不适、肌痛或中风，可能是感染性心内膜炎，也应进行血培养。4．骨髓培养与血液培养的送检指征是基本一致的，临床常规血液感染有指征时以抽取血培养为主。但当骨髓炎时或长期使用抗菌药物患者，抽取骨髓培养阳性率会远高于血培养。5．各种无菌体液标本，如胸腹水、浆膜腔积液及各种穿刺液等亦可注入血培养瓶以提高培养的阳性率。二、血培养次数和采血时间(一)总的采血原则采血培养应该尽量在使用抗菌药物之前进行(心内膜炎除外)，在24小时内采集2～3份血培养(一次静脉采血注入多个培养瓶中应视为单份血培养)。如有可能最好同时做厌氧菌培养。对间歇性寒战或发热的患者，应在寒战或体温高峰到来之前0.5～1小时采集血液，或于寒战或发热后1小时采集，因为发热时血液中可能没有细菌。在采集血培养后的2～5天内不需要再重复采血培养(除外心内膜炎和导管相关性败血症)，因为进行治疗后的2～5天血液中的感染细菌不会马上消失。(二)特殊的全身性和局部感染患者采血培养的建议1．可疑急性原发性菌血症、真菌菌血症、急性脑膜炎、骨髓炎、关节炎、细菌性肺炎、肾盂肾炎发热患者，应在不同部位(如两臂)采集2～3份血标本(应在抗生素治疗前完成)。2．不明原因发热，如隐性脓肿，伤寒热和波浪热，第1天内相隔1小时在不同部位连续采集2～3份血标本，当培养24～48小时后若为阴性，应再采集2～3份血培养。3．可疑菌血症或真菌菌血症，但血培养持续阴性，应改变血培养方法，以获得罕见的或苛养的微生物。4．可疑细菌性心内膜炎：急性病例，在抗生素治疗或改变前1～2小时内从不同部位采集3份血标本；亚急性病例，第1天24小时内相隔1小时连续采集3次血标本，若24～48小时全部阴性，再采集2～3次血标本；若已经抗生素治疗患者，连续3天，每天取2次血标本，可选用能中和或吸附抗菌药物的培养基。三、采集部位及血量以无菌方法从患者肘静脉或股动脉采血。采血量以培养基的1/10为宜，成人采血量8～10ml，儿童3～5ml，婴幼儿为1～2ml。四、采血操作流程和要求1．先准备好采血用具(手套、止血带、注射器、血培养瓶、消毒剂、棉签等)并将贴有条形码的血培养瓶准备好。2．戴好帽子、口罩进行操作，采血前应先洗手。3．皮肤消毒前，先检查血培养瓶有无损坏或超过保质期，用75％酒精消毒血培养瓶橡皮塞，待干燥60秒。4．系上止血带，用沾有0.2％碘醇消毒剂的棉签，以穿刺点为圆心，以约5cm直径画圈进行皮肤消毒，作用时间至少30秒，待干燥后穿刺采血。注意消毒过的地方不能重复涂抹，在涂抹的过程中棉签必须也要同时旋转。如果患者手臂皮肤不够干净，则需重新5．用注射器穿刺取血后，排尽针头内空气，勿换针头，(如果行第2次穿刺，应换针头)，直接注入消毒后的血培养瓶中，轻轻混匀以防止血液凝固。五、标本运送1．采集后血培养瓶应立即送到微生物实验室，一般不得超过2小时。2．如因某种原因不能及时送检，应将已采集好的血液培养瓶放在室温，切勿放入冰箱内冷藏或冷冻。六、注意事项1．标本采集过程中必须严格无菌操作，以免将污染菌误以为病原菌。2．要保证足够的标本量，以提高血液或骨髓培养的阳性率。3．待乙醇完全干燥后再采血，以防消毒剂被带入。4．对已用抗菌药物输液不能中止的患者，应在下次用药之前采集标本，最好进行连续性动态血培养观察。5．对已用抗菌药物治疗的患者可以使用含中和剂的树脂血瓶，对高度怀疑厌氧菌和真菌感染的患者，可以使用厌氧血瓶和真菌血瓶，对血液患者及小儿可以使用专用血瓶进行血培养。七、检验方法一般血液或骨髓培养推荐同时送检需氧及厌氧血培养，因厌氧菌血液感染约占菌血症病原菌的5％～15％。(一)传统手工血培养检验方法1．培养及转种：将血液或骨髓标本注入培养瓶(培养瓶系实验室自行配制或成品血培养瓶)。置于35℃恒温箱内，每日观察并记录培养瓶的变化，包括肉汤混浊度、沉淀、菌膜、溶血、色素等，双相培养瓶肉汤如有异常，或琼脂斜面上有菌苔、菌落出现，应及时涂片、革兰染色镜检，并根据涂片的细菌形态与染色性选择相应的分离培养基进行转种。转种培养基分别为血平板、巧克力平板、麦康凯、沙保弱、高渗平板等。通常肉汤培养72．如为厌氧培养瓶：则瓶内含85％N2、10％CO2、5％H2，厌氧瓶为密闭型，需逐日观察瓶内肉汤的变化，若需氧瓶无变化，厌氧瓶肉汤有变化，即可考虑有厌氧菌生长，应进行涂片及转种厌氧血平板后置厌氧环境进行分离培养，应注意避免氧气进入培养瓶。3．适当运用盲转法可提高阳性率：血培养12小时后如无明显变化，可盲转1次，同时涂片革兰染色镜检，可提高阳性率。4．血培养的三级报告方式。(1)一级报告：血及骨髓培养当观察到疑有细菌生长时，应以无菌操作方式挑取培养液进行涂片，革兰染色镜检，发现有菌生长并排除污染菌时，应立即将肉汤转种血平板和巧克力平板；厌氧菌转种厌氧血平板，进行需氧和厌氧培养及药敏试验，并将镜检结果、细菌形态及染色性报告临床医师，以供初步选择使用抗菌药物。(2)二级报告：转种平板培养结果于8～12小时，或获初步鉴定和药物敏感试验报告，应立即通知临床医师，此为二级报告。(3)三级报告：将分离菌最终鉴定和药敏试验结果与初级报告比对，作出最终正式报告，通知临床以检查用药正确与否或更改治疗方案。(4)不同目的菌的报告时间：一般细菌培养7天无菌生长可发出报告；厌氧菌应培养2周发出报告；亚急性细菌性心内膜炎、布鲁菌、真菌血培养及钩端螺旋体如7天为阴性可继续培养，延至4周发出报告。(二)自动血培养系统的培养方法1．将血液或骨髓标本注入商品血培养瓶中，置于自动血培养仪进行培养，不同培养仪通过不同原理可监测出培养液的变化，随时发出警铃告示。2．用无菌注射器将报警之培养液抽出并转种血琼脂平板和巧克力平板或厌氧血平板，35℃孵育，同时作涂片镜检和直接药敏试验，再按三级报告程序进行，厌氧培养按厌氧3．若在预定期限未出现阳性结果，可发出阴性结果报告。(三)特殊细菌培养方法1．分支杆菌血培养：可用特殊培养基接种血标本、BACTEC13A培养基为分离血液中分支杆菌的专用培养基，采血量为5ml；此外，使用裂解一离心技术、BACTEC12B、Bact/A-1ert(r)MP2．L型细菌血培养：将血液标本注入高渗培养基中进行培养，可分离出细胞壁缺陷病原菌(即L型细菌)。3．真菌血培养：使用需氧血培养瓶、双相培养基、裂解一离心技术或脑心浸液肉汤均可分离到血液中的真菌，一般念珠菌培养5～7天即可生长，阴性结果应于22～30℃孵育44．苛养菌培养：对疑为某些营养要求苛刻、生长速度迟缓的革兰阴性杆菌(如嗜沫嗜血杆菌、伴放线杆菌、金氏杆菌、军团菌、布鲁菌等)引起的心内膜炎血培养标本，主张延长培养时间至2～4周，并转种特殊营养培养基进行培养。5．营养变异链球菌：该菌需在含有巯醇复合物和维生素B6。培养基中生长，因此传代培养中宜补充0.001％盐酸一吡哆醛和0.05％～0.1％L型半胱氨酸促进生长；也可将培养物转种于血琼脂平板上，然后交叉画线接种金黄色葡萄球菌ATCC25923(因其为室内质控标准株，易于获得且较稳定)，在金黄色葡萄周围可见营养变异链球菌卫星样生长菌落。八、临床意义正常人血液和骨髓是无菌的，血液与骨髓培养对血液感染的诊断具有非常重要的意义，被称为金标准。由于现代医学的飞速发展，各种高效广谱抗生素的广泛应用、耐药菌株不断产生和播散、医院感染率不断上升，血培养分离菌的种类及数量不断增加，条件致病菌和非致病菌也可引起免疫功能低下者严重的血液感染，除需氧菌、厌氧菌、真菌菌血症外，有6％～15％的菌血症为复数菌感染，长期使用抗生素者还会出现L型细菌感染，因此，临床微生物工作者应熟知感染菌变迁的动向，准确、快速地培养和鉴定出血液感染菌，并与临床医师经常沟通，共同研讨最佳抗感染化疗方案，提高临床治疗水平。一般在排除外界污染，标准的无菌操作下，血液和骨髓培养分离菌应为血液感染病原菌，可根据药物敏感试验结果选择敏感抗生素进行治疗，选药原则为选用敏感性高、价格合理、副作用小的药物治疗。九、血液感染常见病原菌血液与骨髓培养常见病原菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两大类型。(一)革兰阳性菌1．革兰阳性球菌：金黄色葡萄球菌(多为甲氧西林耐药菌株)、凝固酶阴性葡萄球菌(多为甲氧西林耐药菌株)、肠球菌、A群链球菌、B群链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌等。2．革兰阳性杆菌：产单核李斯特菌、分支杆菌(包括非典型结核杆菌)、炭疽芽孢杆菌等。(二)革兰阴性菌1．革兰阴性球菌：脑膜炎奈瑟菌、卡他莫拉菌等。2．革兰阴性杆菌：伤寒沙门菌、非伤寒沙门菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、气单胞菌、沙雷菌等。铜绿假单胞菌、不动杆菌属、嗜麦芽寡养单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、流感嗜血杆菌等。(三)真菌白色念珠菌、其他念珠菌、曲霉菌、毛霉菌等。(四)厌氧菌拟杆菌属、具核梭杆菌、丙酸杆菌、消化球菌、韦荣球菌等。第二节痰标本细菌学检测一、采集指征有下列体征之一，应进行痰培养：1．咳嗽、咳痰、痰液为脓性、血性、铁锈色或红棕色胶冻样痰。2．咯血：包括泡沫血痰、鲜血和痰中带血等。3．呼吸困难、呼吸急促或哮喘，常伴有胸痛。4．发热伴白细胞增高尤其是中性粒细胞或CRP明显增高。5．胸部影像学检查提示有感染可能。二、采集方法1．自然咳痰法：患者清晨起床后，用清水反复漱口后用力自气管咳出第一口痰于无菌容器内，立即送检。痰液较深不易咳出时，可在咳痰前扣背协助排痰。对于痰量少或无痰的患者可采用雾化吸入加温至45℃的10％NaC12．小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，将无菌棉拭子伸人咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上。对咳痰量少的幼儿，可轻轻压迫胸骨上部的气管，使其咳嗽。3．支气管镜采集法：用支气管镜在肺内病灶附近用导管吸引或用支气管刷直接取得标本。4．气管切开者取痰法：消毒气管套管口，以无菌吸痰管插入气管抽吸痰液，注入无菌试管立即送检。具体操作方法：①打开一次性吸痰管，接好负压吸引器；②用左手拇指将接头外折曲堵住并持吸痰管，右手持无菌镊夹持吸痰管；③将吸痰管送到气管最深处，刺激患者咳嗽，开放负压吸引；④左手拇指松开吸引，见痰液吸入吸痰容器中时，左手拇指迅速将接头折曲堵住；⑤拔出吸痰管，脱开吸引器接头；⑥将痰液容器上与吸痰管连接的盖子取下，将底部的盖子盖上；⑦在容器上注明患者姓名和科室后，立即送检。三、标本运送痰标本采集后应立即送检，常规培养不超过2小时，送实验室后立即接种。四、注意事项1．采集标本以清晨为佳，为减少口腔正常菌群污染标本，采集前应先用漱口液充分漱口。2．在应用抗菌药物之前采集标本。3．做结核分支杆菌和真菌培养的标本不能及时送检的，可放4℃4．肺部感染的患者有25％～50％可能发生菌血症，应同时做血培养。5．采集标本时应戴口罩和手套，避免交叉感染。五、检验方法．(一)细菌形态学检查将痰标本涂片后待干、固定、染色，或直接湿片镜检，对病原学早期、初步诊断有价值。湿片直接镜检以相差显微镜观察效果好，对于一些特定的病原菌如军团菌、结核分支杆菌则用荧光显微镜检测为佳。一般认为合格的痰标本应是含白细胞、脓细胞和支气管柱状上皮细胞较多，而受污染的痰标本则是来自颊黏膜的扁平鳞状上皮细胞较多。以白细胞＞25个/低倍镜视野，而鳞状上皮细胞＜10个/低倍镜视野为合格标本。采集合格标本对细菌的诊断尤为重要。1．一般细菌涂片检查：进行革兰染色镜检，根据着色、形态及排列大致可以初步推断菌属(或种)，如见到革兰阳性球菌、呈堆(葡萄状)排列，疑似葡萄球菌；如见到瓜子形态、矛头状、尖端相背的成双排列、可有荚膜的革兰阳性球菌疑似肺炎链球菌等，可发出初步报告。2．结核杆菌涂片检查：抗酸染色后，根据所见结果报告找到(或未找到)抗酸杆菌。3．放线菌以及奴卡菌涂片检查：将痰液用生理盐水反复洗涤数次，如含血液则加蒸馏水溶解红细胞，挑取黄色颗粒(硫磺颗粒)或不透明的着色斑点，置玻片上加压并覆以盖玻片，高倍镜下观察其结构，如见中央为交织的菌丝，其末端粗杆形呈放线状排列时揭去盖玻片，干后做革兰及抗酸染色镜检。如查见中央部分菌丝为革兰阳性，而四周放射的末梢菌丝为革兰阴性，抗酸染色为非结核性者，可报告找到疑似放线菌。如查见革兰染色反应与放线菌相同，但抗酸染色为弱抗酸性，可报告找到疑似奴卡菌。4．厌氧菌涂片检查：涂片染色同一般细菌，镜检时注意有芽孢的革兰阳性杆菌可能是梭状芽孢杆菌属；如见芽孢部位菌体不膨大，排列呈竹节状，要注意炭疽芽孢杆菌；两端尖的革兰阳性杆菌可能为梭状芽孢杆菌；如为革兰阴性无芽孢杆菌，伴痰有恶臭，可能有拟杆菌。总之，根据细菌的着色、形态、排列做出初步诊断。(二)细菌分离培养与鉴定1．一般要求：下呼吸道感染培养的细菌浓度应≥107cfu/ml，可视为病原菌，＜104cfu/ml可视为污染菌。若介于两者之间如105～106cfu/ml时，要连续分离培养两次以上仍为105～106cfu/ml时，也认为是病原菌。2．痰培养标本的前处理：一般是用无菌生理盐水将痰洗涤3次，主要是洗去痰中的常居菌，然后向痰液中加入等量的(pH值7.6)1％胰酶溶液，放置37℃90分钟，即可使痰3．普通细菌培养：将处理后的脓痰接种于血琼脂、中国蓝琼脂平板、巧克力琼脂平板上，分别放入普通和5％～10％CO2环境，35％18～24小时后观察菌落特征并涂片行革兰染色，根据菌体的形态、特点做出初步鉴定。4．结核分支杆菌培养：培养前先对痰中的杂菌进行处理后。将其接种于改良罗氏培养基，置35℃培养，一般第一周观察2次，以后每周1次，观察菌落出现的时间、形态，阳性结果随时发出报告，阴性者65．嗜肺军团菌培养：将均质化的标本接种于血琼脂、巧克力琼脂和BCYE琼脂平板上，置35℃5％CO2环境中培养。若在上述培养基中24小时内有细菌生长，此菌则不是军团菌。如在BCYE平板上486．厌氧菌培养：将采集的厌氧菌标本接种于厌氧培养基，生长后将细菌进行鉴定，发出报告。六、临床意义痰及下呼吸道标本的细菌学检验对于某些疾病的诊断具有很重要的意义。1．细菌性肺炎为下呼吸道感染最常见的类型，近年调查表明，原来由肺炎链球菌所致肺炎仍为常见，由流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、MRSA和革兰阴性杆菌所致肺炎比例明显上升，军团菌肺炎也引起了人们的重视。在医院感染中，革兰阴性杆菌占50％以上而成为主要病原体，一些条件致病菌和耐药菌成为医院内肺炎的主要致病菌。2．真菌性肺炎是致病性真菌和条件致病性真菌所引起。目前以条件致病性真菌感染致病为主，并呈上升趋势，常见菌以白色假丝酵母菌为主，毛霉菌、曲霉菌和隐球菌也常见。真菌性肺炎常合并其他多种细菌感染，患者常由于使用大量抗生素而发生双重感染，病情严重，给治疗带来困难。七、呼吸道感染常见病原菌呼吸系统感染的患者，检出病原菌机会相当高，但是必须区分是病原菌还是上呼吸道的正常菌群，因为当机体抵抗力降低时，弱毒菌均可成为呼吸系统感染的重要病原菌，因此条件致病菌分离时尤应注意。结核杆菌如从痰中检出，即可认为有临床意义。关于病原菌的确定，一般认为，经过洗净法处理的痰培养，结果比较可靠。此外，亦可反复几次检查，分析比较，如多次分离到同一致病性比较弱的细菌也应考虑为病原菌。呼吸道常见病原菌如下。1．革兰阳性菌：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、厌氧链球菌、结核分支杆菌、放线菌、奴卡菌、白喉棒状杆菌、炭疽杆菌。2．革兰阴性菌：卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、其他肠杆菌科细菌、假单胞菌属细菌、嗜肺军团菌、百日咳鲍特菌、拟杆菌。3．其他。肺炎支原体、奋森螺旋体、肺炎衣原体、假丝酵母菌。第三节尿液标本细菌学检测一、采集指征有典型的尿路感染症状；肉眼脓尿或血尿；尿常规检查表现为白细胞或亚硝酸盐阳性；不明原因的发热，无其他局部症状；留置导尿管的患者出现发热；膀胱排空功能受损；泌尿系统疾病手术前。二、采集方法1．中段尿采集法：留取早晨清洁中段尿标本。女性：采样前用肥皂水清洗外阴部，再用0.1％高锰酸钾溶液冲洗外阴部尿道口，灭菌纱布擦拭，用手指将阴唇分开排尿，弃去前段尿，留取中段尿10ml于无菌容器中，加盖立即送检。男性：翻转包皮，用肥皂水清洗尿道口，后用清水冲洗，弃取前段尿，留取中段尿约5～10ml于无菌容器中，加盖立即送检。2．耻骨上膀胱穿刺：先对穿刺部位进行皮肤消毒，然后使用无菌注射器直接从耻骨上穿人膀胱吸取尿液，主要用于厌氧菌培养或留取标本困难的婴儿尿标本的采集。3．直接导尿法：按常规方法对会阴部进行消毒后，用导尿管直接经尿道插入膀胱，先让尿流弃15ml再留取培养标本。4．留置导尿管收集尿液：用75％的酒精消毒导管接口，用注射器穿刺导尿管抽取5～10ml尿液，置于无菌容器中送检；或拔去闭式引流的集尿袋，75％的酒精消毒接口后弃去导尿管前段尿液，留无污染的膀胱内尿液送检。三、标本运送标本采集后，应立即送检。膀胱穿刺做厌氧培养时，应避免接触空气，针头插上灭菌橡皮塞，立即送检。尿液如不能立即送检者，则必须保存于4℃冰箱，时间不超过6四、注意事项1．采集尿液标本应在使用抗菌药物之前进行，防止药物对细菌的抑菌作用。2．应取清晨第一次尿液送检。3．尿液采集应严格进行无菌操作，防止污染。4．采集时应注意不要让外阴消毒剂混入标本，引起抑菌后果。5．对留置导尿者，不可从集尿袋的下端管口留取标本。五、检验方法(一)涂片法1．一般细菌涂片：以无菌操作取尿液10ml左右放入无菌试管中，经3000r/min离心15分钟，弃去上清液，取沉渣涂片，进行革兰染色，如发现革兰阳性或革兰阴性菌，可根据细菌的染色性和形态，作出初步报告。2．假丝酵母菌检查：取尿液离心沉淀物置于清洁玻片上，加盖玻片后用高倍镜观察，若沉渣太多，可滴加10％的NaOH，使沉渣溶解后再镜检，或制成涂片革兰染色油镜检查，如发现革兰阳性卵圆形芽生孢子或假菌丝，即可作出初步报告。3．淋病奈瑟菌检查：取尿液沉淀物置于清洁玻片上，制成涂片，革兰染色，油镜检查，如发现革兰阴性双球菌，呈肾型，存在于细胞内或细胞外，即可作出初步报告。4．结核分支杆菌检查：取尿液10ml左右经3000r/min离心30分钟，取沉渣涂片，进行萋一纳及潘本汉染色，若两种涂片均查见红色杆菌，即报告“找到结核分支杆菌”，如萋一纳染色找到红色杆菌，而潘本汉染色中未发现红色杆菌，则为耻垢分支杆菌，也可用金胺“0”荧光法进行染色后(二)培养检查1．一般细菌培养：用无菌接种环取尿液接种于血琼脂平板和麦康凯Macc(或中国蓝EMB)平板上，35℃培养18～24小时，观察结果，根据菌落形态特征及涂片镜检结果，选择相应方法作进一步鉴定，如培养482．特殊细菌培养。(1)淋病奈瑟菌培养：尿标本收到后立即接种于预温35℃的巧克力琼脂平板，置35℃5％～10％CO(2)结核分支杆菌培养：将尿液接种于血琼脂平板上，35℃培养18～24小时后无细菌生长，可将尿液3000r/min离心30分钟后取沉淀物0.1ml(3)假丝酵母菌培养：将尿液接种沙保弱琼脂平板上，25～30℃(4)厌氧菌培养：用穿刺尿进行培养，接种厌氧血琼脂平板，厌氧环境中培养。(三)定量培养1．平板接种法：用定量加样器取5ml尿液滴注在琼脂平板上，用接种环涂抹均匀，35℃培养24小时，生长的菌落数乘以200，即为每ml2．定量接种环法：用定量接种环蘸取尿液标本(10μl)在血琼脂平板上作均匀画线接种，置35℃培养24小时，计数生长的菌落数乘以100，即为每ml尿中细菌数，若平板上菌落数超过1000个，则报告：菌落数＞105cfu/ml3．倾注平板法：取被检尿液0.1ml，加入9.9ml无菌生理盐水中充分混匀，取此液1ml放入直径为9cm的无菌平皿内，同时加入已融化并冷却至50℃的琼脂培养基与尿液混匀，凝固后置35℃培养24小时，计数生长菌落乘以100六、临床意义尿液细菌学检验对肾脏、输尿管、膀胱、尿道、前列腺等处的炎症变化具有诊断价值，随着抗生素的应用，可通过药敏试验帮助临床医师合理选择抗菌药物，减少因用药不当而造成的耐药菌株的增加。目前一般认为采取清洁中段尿，诊断泌尿道感染的细菌数标准是：菌落数＞105cfu/ml。但由于某些原因的影响：如使用过抗菌药物、使用过利尿剂或尿频、采尿时外阴消毒液混入尿中或病原菌生长营养要求较高，使细菌繁殖受抑制等原因，菌落数在105cfu/ml以下，也不能完全排除尿路感染。七、尿道感染常见病原菌引起尿道感染的常见病原菌如下。1．革兰阴性菌：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌、沙雷菌、变形杆菌、普罗威登斯菌属等的菌种、阴道加德纳菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌属、淋病奈瑟菌。沙门菌、志贺菌较少见。2．革兰阳性菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肠球菌、β-溶血链球菌(通常为B群、A群、D群)、厌氧链球菌、结核杆菌。3．其他细菌：假丝酵母菌。第四节脓液标本细菌学检测一、采集指征1．软组织的急性化脓性炎症：当局部有红、肿、热、痛和功能障碍等典型症状时，可能存在化脓性感染，但局部症状随病程的迟早、病变范围、位置深浅而不同。如疖、痈、急性蜂窝织炎、丹毒等。2．化脓性疾病：如甲沟炎、化脓性关节炎、化脓性骨髓炎、气性坏疽、细菌性结膜炎、鼻窦炎、化脓性扁桃体炎、急性化脓性中耳炎、急性化脓性乳突炎、急性乳房炎、急性胆囊炎、急性梗阻性化脓性胆管炎、心包炎、结核性腹膜炎等。3．脓肿：扁桃体脓肿、咽部脓肿、咽旁脓肿、脑脓肿、肺脓肿、肝脓肿、脓胸、腹腔脓肿、肾皮质化脓性感染、肾周围炎和肾周脓肿、直肠肛管周围脓肿。4．创伤感染：术后切口感染、导管感染、脐带残端感染。二、标本采集1．开放性感染和已溃破的化脓灶：外伤性感染、癌肿溃破感染、脐带残端、外耳道分泌物等感染部位与体腔或外界相通，标本采集前先用无菌生理盐水冲洗表面污染菌，用无菌拭子采取脓液及病灶深部的分泌物，置无菌试管内送检。注意尽量取化脓组织与正常组织交界处的脓汁，因为脓汁中心的细菌大部分已死亡，交接处的活菌较多，会提高阳性率。开放病灶不能做厌氧培养。2．闭锁脓肿：一般采用穿刺或手术引流的方法采取。采集前先用1％活力碘和75％的酒精消毒周围皮肤后，用无菌注射器抽取脓液送检；也可于切开排脓时用无菌注射器或棉拭子采样。盛于无菌容器内或厌氧运送系统送检。3．抽取液体：包括胸腔积液、腹腔积液、盆腔积液、关节腔积液、胆汁、心包积液等，首先消毒皮肤，然后在手术引流时或经穿刺术抽取标本，注入血培养瓶或无菌容器或厌氧运送系统送检。三、标本运送标本盛于无菌容器内或厌氧运送系统，室温下15分钟内送检，最长不超过2小时送达实验室。四、注意事项1．尽可能在用药前采集标本。如患者在采集标本前已用药，请在检验申请单上注明，检验人员可在培养基内加入相应拮抗物，以利于提高阳性检出率。2．采集标本时应注意脓汁及分泌物的性状、颜色及气味，为分离鉴定致病菌提供依据。3．疑有某种细菌感染，若该细菌对干燥敏感，用无菌棉拭子采集标本后，应立即放入液体培养基内；或采标本前先将无菌棉拭子沾少许肉汤以保持标本湿度。4．不能立即送检的标本，应放4℃5．深部脓肿常由包括厌氧菌在内的混合细菌感染所致，采集标本应遵守厌氧菌感染标本的采集原则。五、检验方法(一)涂片检查1．革兰染色检查：分泌物或脓液涂片可以为单一菌种，也可为混合菌种，应注意是否有厌氧菌。可报告“找到革兰阴(阳)性菌，形态可能为××菌”。2．抗酸染色检查：有些感染可能是结核杆菌引起的，直接抗酸染色有助于初步诊断，此外有利于发现奴卡菌和放线菌。(二)细菌培养1．普通细菌培养：取脓汁棉拭子或脓汁接种血平板上画线分离，置35℃培养18～24小时，观察结果，如有菌落生长，根据涂片染色特点和菌落特征初步判断细菌的类属，然后再按其生物学特性进行鉴定。如培养48～722．厌氧菌培养：取脓汁棉拭子或脓汁接种厌氧血琼脂平板，厌氧环境中培养。3．苛氧菌培养：取脓汁棉拭子或脓汁接种沙保弱琼脂平板上，25～30℃4．结核分支杆菌培养：取脓汁棉拭子或脓汁接种于血琼脂平板上，35％培养18～24小时后无细菌生长，再将沉淀物接种在罗氏培养基上。5．真菌培养：取脓汁棉拭子或脓汁接种沙保弱琼脂平板上，25～30℃6．以色列放线菌和星型奴卡菌培养：采取“硫磺样颗粒”或脓肿液接种于硫乙醇酸钠肉汤或深层葡萄糖肉汤琼脂培养基，置35℃厌氧培养，同时接种沙保弱葡萄糖琼脂斜面，置22～28℃培养。经过4天培养后，若在厌氧培养的葡萄糖肉汤琼脂平板上有白色、粗糙、或结节状的菌落，黏附于培养基上不易用接种环取下，且在盐水中不易乳化，而在需氧培养的平板上无类似菌落生长时，可疑为以色列放线菌。如有奴卡菌生长，则在需氧培养的沙保弱培养基上出现光滑、不规则折叠或颗粒状的菌落，具有黄色至橙黄色的颜色，取菌落作湿片镜检，如发现精细分支状菌丝，革兰染色阳性，抗酸染色弱阳性的菌丝，可报告“有奴卡菌生长六、临床意义所有创伤均可有细菌污染，但不一定发生感染，细菌学检查局部细菌的控制是有价值的。同时对导致伤口感染、脓肿形成的病原学诊断有重要意义。确定常居菌是否为创伤感染的病原菌时，要注意该菌是否在数量上占优势。目前临床上区分创伤感染或污染，主要看细菌向活组织深部侵入程度及每克组织含细菌量是否达到定阈值。一般认为每克组织内细菌数量在105～106个以上时即可造成伤口感染。浅部软组织脓肿多由表皮葡萄球菌感染，而大的和严重的脓肿多由金黄色葡萄球菌感染引起，大肠埃希菌及乙型溶血性链球菌也可引起化脓性感染。由外伤性、血源性或邻近组织病灶直接蔓延所致的急性化脓性骨关节炎常由金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌或伤寒沙门菌感染所致。慢性化脓性骨关节炎可由与急性期相同的病原菌引起，也可由结核分支杆菌引起，以结核分支杆菌引起的感染较常见。可通过涂片抗酸染色和分支杆菌培养确定病原学诊断，由金黄色葡萄球菌感染的骨髓炎的致病菌占80％～90％，乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌、厌氧菌、大肠埃希菌和沙门菌的感染也有报道。由外伤性创伤引起的化脓性胆囊炎，几乎都有细菌污染的可能，同时大多数会发生不同程度的感染，以葡萄球菌和链球菌多见。深部外伤和骨折，由于有尘埃或异物污染，极易发生破伤风和气性坏疽等厌氧菌感染。通过穿刺或手术采集脓液进行细菌学检查可作出病原学诊断，也有利于临床治疗措施的制定。七、脓肿、伤口感染常见病原菌引起伤口、软组织感染的常见病原菌。1．革兰阴性菌：大肠埃希菌、克雷伯菌、肠杆菌、变形杆菌、假单胞菌属、沙雷菌等阴性杆菌及卡他莫拉菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌等阴性球菌。2．革兰阳性菌：破伤风芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌、类白喉棒状杆菌、结核分支杆菌等阳性杆菌及金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、四联球菌、消化球菌、消化链球菌等阳性球菌。3．其他细菌：假丝酵母菌、以色列放线菌、星型奴卡菌等。第五节粪便标本细菌学检测一、采集指征当腹泻患者出现以下任何一种情况时建议采集粪便标本，进行细菌培养：粪便涂片镜检白细胞≥5个/HP；重症腹泻；T＞38.二、标本采集(一)标本采集时间在发病早期和使用抗菌药物治疗前，不同时间采集2～3个标本可以提高致病菌的检出率。沙门菌感染，肠热症在2周以后；胃肠炎患者在急性期，早期采集新鲜粪便。(二)采集方法1．自然排便采集法：自然排便后，挑取有脓血、黏液部分的粪便1～3g，液状粪便则取絮状物1～3ml盛于无菌容器内送检。2．直肠拭子法：如不易获得粪便时或排便困难的患者及幼儿，可用肥皂水将肛门周围洗净，用蘸有无菌生理盐水的棉拭子插入肛门，成人约4～5cm，儿童约2～3三、标本运送1．粪便标本应尽快送检，室温下不能超过2小时。2．直肠拭子采集的标本必须放入送检培养基或GN肉汤中送检，转运时间不超过2小时。3．霍乱弧菌感染高度可疑标本的运送必须符合特殊标本的安全要求。4．直肠活检标本容器内盛少量无菌生理盐水以防沉淀。四、注意事项1．虽粪便含有多种杂菌，但应尽量采用无菌容器。2．为提高检出率，要采集新鲜粪便作培养。3．腹泻患者应尽量在急性期采集标本(3天)以内，以提高阳性率。4．标本最好在使用抗菌药物前采集。5．用于厌氧培养的标本应尽量避免与空气接触，最好在床边接种。五、检验方法(一)直接涂片检查粪便标本因各种正常菌群含量甚多，仅从细菌的染色性和形态无法分辨是否为病原菌，只有少数细菌，如霍乱弧菌、结核分支杆菌、难辨梭菌、葡萄球菌以及假丝酵母菌才做直接涂片检查。1．霍乱弧菌涂片检查。(1)染色检查：粪便通常为米泔样，取新鲜标本涂片2张，用乙醇或甲醇固定，分别作革兰染色及1∶10稀释的苯酚复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性，呈鱼群样排列的杆状或弧形菌。(2)悬滴(压滴)检查：取粪便制成悬滴(压滴)标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典生物型和El-Tor生物型均呈穿梭状运动。在悬滴涂片中加入O1群或O139群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。可初步报告为“疑似O1群霍乱弧菌”。申报上级卫生机构作出处理，并做好患者消毒隔离工作。2．葡萄球菌涂片检查：疑似葡萄球菌伪膜性肠炎患者，取水样便或肠黏膜样物涂片，革兰染色后镜检，可见革兰阴性杆菌明显减少，有大量革兰阳性球菌散在或成堆(葡萄状)排列。3．难辨梭菌涂片检查：取新鲜粪便涂片，革兰染色后镜检可见革兰阳性粗大杆菌，无荚膜，大多能形成卵圆形芽孢位于菌体一端，可初步报告为“找到革兰阳性芽孢杆菌，疑似难辨梭菌”。4．结核分支杆菌涂片检查：取蚕豆大小粪便与饱和生理盐水10～15ml混合，静置1～2小时，取浮面液体涂片作抗酸染色，若找到红色杆菌可报告“找到抗酸杆菌”。5．空肠弯曲菌涂片检查：将粪便涂片作革兰染色，可见细小、长而弯曲的革兰阴性弧形、S形、螺旋形、成海鸥状的细菌，可作初步报告疑似弯曲菌。6．假丝酵母菌涂片检查：将粪便制成压滴标本，高倍镜观察可发现光亮的卵圆形孢子或假菌丝。涂片革兰染色可见革兰阳性瓜子形状的孢子或假菌丝。若仅见到孢子则报告找到革兰阳性卵圆形芽生真菌孢子，同时还有假菌丝则可报告检出假丝酵母菌。(二)培养检查1．一般细菌培养：取粪便接种于血琼脂平板，EMB(或MACC)琼脂平板，经35℃培养18～242．特殊细菌培养。(1)霍乱弧菌。1)直接分离培养：将疑似霍乱弧菌感染的标本除增菌外，同时接种庆大霉素平板(或TCBS平板)35℃培养16～18小时(增菌管6～82)增菌后分离培养：一般情况下将标本直接接种碱性胨水增菌，于35℃培养6～8小时转种庆大平板进行分离鉴定，必要时可作2(2)副溶血弧菌：将标本接种于副溶血弧菌增菌液中，同时接种血平板和TCBS平板，35℃培养18～24(3)小肠结肠炎耶尔森菌：将标本接种于小肠结肠炎耶尔森菌培养基(NYE)中，22～25qC培养48小时。(4)艰难梭菌：将标本立即接种CCFA(环丝氨酸一甲氧头孢菌素一果糖琼脂)平板上，或将标本作10-6～10-2稀释后定量分离培养，厌氧环境30～37℃培养48(5)空肠弯曲菌：接种于弯曲菌选择培养基(camy-BA血琼脂)；或接种CEM增菌液(经42℃微需氧培养24～48小时后，再接种上述选择培养基上)，在微需氧条件下培养，最好采用混合气体(85％N2、10％CO2、5％O2)的方法，培养24～48(6)结核分支杆菌：将粪便标本首先进行培养前处理，然后接种罗氏培养基，置35℃培养6～8(7)假丝酵母菌：将标本接种于含氯霉素的沙保弱琼脂和血琼脂平板上置25～30℃和35℃培养24～3．菌群失调及菌群交替症细菌培养：正常菌群失调培养，应根据临床提示选用多种培养基，包括强选择和弱选择性肠道菌培养基、需氧及厌氧血琼脂平板、甘露醇食盐琼脂平板、Camp-BA平板、沙氏琼脂平板等，将标本接种上述各平板，分别孵育，22％、35℃、42六、临床意义肠道病原菌能引起人类感染性腹泻，致病菌能够破坏宿主的防御系统，侵袭人体组织，其产生的毒素能引起食物中毒。长期应用抗菌药物能导致菌群紊乱而引起严重腹泻，因此，粪便培养能为临床及早作出诊断提供依据。七、肠道感染常见病原菌人类肠道中细菌繁多，种类亦多。在健康人肠道内经常寄居着大量的厌氧菌和小部分的兼性厌氧菌。肠道中细菌种类受食物的影响，除人乳喂养的婴儿肠道内以革兰阳性菌为主外，其余的人肠道内均以革兰阴性菌占优势。这些细菌一般不引起疾病，一旦肠道发生病理改变时，就可能侵入病变部位引起疾病。常见病原菌如下。1．革兰阴性菌：沙门菌、志贺菌、致病性大肠埃希菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、气单胞菌、邻单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞菌、迟缓爱德华菌。2．革兰阳性菌：金黄色葡萄球菌、难辨梭菌、肠球菌、厌氧链球菌、产气荚膜梭菌。3．其他细菌：假丝酵母菌、结核分支杆菌。第六节脑脊液标本细菌学检测一、采集指征1．成人：发热、头痛、恶心、呕吐、颈强直和反射增强等症状，怀疑为脑膜炎的患者。2．儿童：因儿童和新生儿的临床表现不明确和无特异性，因此对于婴儿不明原因发热，应怀疑为脑膜炎，采集脑脊液。3．具有下列实验室检查之一。(1)脑脊液的白细胞增加，蛋白质升高，葡萄糖减少。(2)脑脊液革兰染色发现微生物。(3)血培养阳性。(4)脑脊液、血液、尿液标本对某种病原体抗原反应呈阳性。(5)血清抗体滴度有意义的增加。二、采集方法用腰穿方法采集脑脊液3～5ml。患者应先禁食，由医师以无菌操作在患者第3和第4腰椎间隙或稍低处穿刺取得，小儿则于第4和第5腰椎间隙穿刺，装入无菌试管，立即送检。如果用于检测细菌或病毒，脑脊液量应≥1ml，如果用于检测真菌或抗酸杆菌，脑脊液量应≥2ml。三、标本运送1．如果用于检测细菌，收集脑脊液后，在常温下15分钟内送到实验室。脑脊液标本不可置冰箱保存，否则会使病原菌死亡，尤其是脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌。2．如果用于检测病毒，脑脊液标本应放置冰块，在4℃15分钟内送到实验室。用于检测病毒的脑脊液，在4℃可保存四、注意事项1．最好在使用抗生素之前采集标本。2．如果只采集到一管脑脊液而要做不同检查，应首先送到微生物室。3．采集脑脊液的试管不需要加入防腐剂。4．进行腰穿过程中，严格无菌操作，避免污染。五、检验方法(一)涂片法因脑脊液是无菌的，只要检出细菌即可诊断感染的类型，所以直接涂片很重要。1．革兰染色：肉眼观察，混浊或脓性脑脊液可直接涂片。无色透明的脑脊液，首先3000r/min离心10～15分钟，用沉淀物涂片，革兰染色，根据细菌形态，可初步提示感染细菌的种类。(1)检查到革兰阴性，凹面相对的球菌，细菌有时位于细胞内，有时位于细胞外。此时可报告临床“找到革兰阴性双球菌，位于细胞内(外)，形似脑膜炎奈瑟菌”。(2)检查到革兰阳性，菌体周围有明显荚膜双球菌，可报告“找到革兰阳性双球菌，形似肺炎链球菌”。(3)检查到革兰阴性，多形态、菌体大小不一，有杆状或耸状的细菌，可报告“找到革兰阴性杆菌，形似流感嗜血杆菌”。(4)检查到小的、规则的革兰阳性杆菌，单独或呈V形排列，出现于大量单核细胞之间者，可报告“找到革兰阳性杆菌，形似产单核李斯特菌”。(5)检查到革兰阳性孢子或菌丝，可报告“找到真菌孢子或菌丝”。(6)检查到上述以外的其他细菌，可报告“找到革兰阳(阴)性球(杆)菌”。2．抗酸染色：4000r/min离心脑脊液30分钟，取沉淀物作涂片，干燥、固定后，用萋纳染色或金胺“0”3．墨汁染色：脑脊液离心3000r/min，10～15分钟后，取沉淀物进行墨汁染色，显微镜下可在黑色背景中，见到菌体周围有透明荚膜，似一晕轮，有时出芽，可报告“找到新型隐球菌”。(二)PCR方法1．由于婴幼儿较难采到脑脊液，对脑膜炎的诊断有较大困难，用PCR技术检测外周血，对脑膜炎奈瑟菌感染者的阳性率为100％，且不受抗生素药物治疗的影响。2．由于结核杆菌在脑脊液中数量较少，因此抗酸染色和培养的阳性率很低，且培养时间长，用PCR技术检测结核杆菌DNA，检出率高且快速，但要排除假阳性。(三)培养检查1．一般细菌培养：将脑脊液离心后的沉淀物接种于血琼脂平板(BA)、巧克力平板(CA)、巯基乙酸肉汤，CA置5％～10％CO2环境中，35℃培养18～24小时，观察有无细菌生长。如果无细菌生长，再转种肉汤，继续培养至722．特殊细菌培养。(1)结核分支杆菌培养：将脑脊液离心后的沉淀物接种于血琼脂平板上，35℃培养18～24(2)假丝酵母菌培养：将脑脊液离心后的沉淀物接种沙保弱琼脂平板上，25～30℃(3)厌氧菌培养：将脑脊液离心后的沉淀物接种厌氧血琼脂平板和其他相应的选择性培养基，置厌氧环境中培养。六、临床意义正常人的脑脊液是无菌的。故在脑脊液中检出细菌(排除标本污染)，都应看作是致病菌。由于引起脑膜炎的细菌种类不同，而治疗、处理和预后均不相同，因此，必须经涂片和培养检查，以确定细菌的种别。此外，新型隐球菌和结核杆菌所致的脑膜炎，在临床上常难以鉴别，更需经细菌检查加以区分。故脑脊液的细菌学检查在临床上具有十分重要的意义。七、脑脊液感染常见病原菌引起脑脊液感染的常见病原菌如下。1．革兰阴性菌：脑膜炎奈瑟菌、卡他布兰汉菌、大肠埃希菌、克雷