农杆菌电击感受态的制备

农杆菌电击感受态的制备—转化及验证农杆菌电击感受态的制备，转化及验证制备农杆菌电转感受态挑取根癌农杆菌EHA105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif)50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28'C,220rpm震荡培养过夜。将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C,220rpm震荡3-4小时，至OD600=左右。(3)5000rpm离心5分钟，去上清。(4)加入40m110%甘油悬浮菌体，冰浴30min.(5)4'C,5000rpm离心5分钟，去上清。(6加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C,5000rpm离心5分钟。(7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于的离心管中(200p1/管)备用。2农杆菌感受态的电转化〔I)取2ul质粒加到200uIEHA105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。马上加入】ml新鲜的LB液体培养基，28'C,150rpm轻摇4-6小时。⑷收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培养基平板上。28°C培养2-3天。其实和大肠杆菌电转化差不多，只不过培养温度是28度，摇的时间长一些，还有就是链霉素和利福平两种抗生素要加上，目的是防止根癌脓杆菌自带质粒的丢失，不过具体要加哪些抗生素还得看你是那种根癌脓杆菌非常感谢我用的不是电转化是把茎和叶浸在农杆菌液里30秒..想知道为什么不是把菌液直接滴在土里可以采用注射法导入农杆菌还有就是把植株取出放入侵染液中用真空渗透法导入感受态制备及转化方案二1、 农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、 农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线，抗生素浓度为：50rg/ml。28C培养。3、农杆菌感受态细胞的制备：1)挑取单菌落接种于3mlLB液体培养基中，220rpm28C振荡培养至OD600=。2)吸取菌液于离心管中，冰浴10min；3)5000rpm离心30s，弃去上清液；4)沉淀用mlNaCl悬浮，冰浴20min；5)5000rpm离心30s，弃去上清液；6)每管用100H20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4C保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70°C保存。使用时从一70°C取出，置冰上融化后使用。4、DNA直接转化农杆菌：1）50H农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA〜捉g,之后冰浴30min；2）放入液氮中5min,然后立即放入37C水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入，28C、220rpm振荡培养3〜5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28C条件下倒置培养。2天左右菌落可见。中28C过夜活化。取2ml过夜菌液接种于50mlYEP培养基中28C生长至OD600约等于左右。5krpm离心5分钟。在10mlNaCl中悬浮细胞。5krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80C待用。加lugDNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。液氮中冷冻1分钟。8.37C水浴溶化细胞。9.加1mlYEP培养基，28C摇床培养2-4hr。10.离心1分钟，悬浮细胞在100ulYEP培养基中。11.涂板，28C培养2-3天。电转农杆菌感受态细胞制备与转化1・挑取单克隆接种于2mlYEP液体培养基，28°C,250rpm,振荡培养过夜。将菌液按1:100转移至200mlYEP培养液中，28C,250rpm，振荡培养至OD=（约4~5h）。转入50ml的无菌离心管，4C,4000rpm离心10min,弃上清。4.用20ml冰浴的HEPES（1mM，）重悬。5.4C，4000rpm离心10min，弃上清。6.重复4、5步骤2~3次。用2ml冰浴的10%甘油重悬。每管100nl分装于无菌的Eppendorf管中，-70C保存。1mMHEPES的配制：称取粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至，灭菌后待用。注：HEPES需现用现配。电击法转化农杆菌感受态细胞取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。加2H质粒DNA于100H感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中（电击杯-20C预冷），在2500V高压下电击。取出电击杯，加入500口l预冷的YEP培养液（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入离心管中，28C，200rpm振荡培养5ho取30-40^l菌液涂在含相应抗生素的YEP平板上，28°C倒置培养~2d。注:1.细胞与质粒的混合物应沿槽壁慢慢加入电击杯中，避免产生气泡。2.电击前擦干电击杯外侧。涂板菌液量可根据菌液浓度作调整。11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111杆菌转化子的验证A.农杆菌转化子的PCR鉴定挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50口g/mlKanamycin的YM液体培养基中，28C,220rpm摇培16hr，直接用菌液做PCR。PCR反应体系如下：反应组分 体积终浓度母液浓度农杆菌转化子菌液 2^lP1(35S)2口l200nM 2^MP2(GUS)2口l200nM2^M10XPCRBuffer2^lMg2+rl25mMdNTPnl150^MTaq酶nl1U5U/HH2OH20HPCR反应参数设置如下：94C预变性3min后开始以下循环反应：94C变性