生理指标测定实验方案汇总

生理指标测定实验方案汇总预测指标：抗氧化酶系统.MDA可溶蛋白.超氧阴离子自由基叶绿素.类胡萝卜素可溶性糖游离氨基酸过氧化氢谷胱甘肽.ASA抗氧化酶系统.MDAA酶活测定试剂：PBS缓冲液0.05M（pH7.8） :取0.663gNaH2P04・2H20和16.384gNa2HP04・12H20,加PVPIOg，并加EDTA或者EDTA盐，使其浓度为2mM,加蒸馏水定容至1L。用前冰箱或冰上预冷。样品制备鲜样0.1-0.5g加入1ml磷酸缓冲液（0.05M,pH7.8） ，稍许石英砂，研磨成匀浆；移入10ml离心管中，再用4ml磷酸缓冲液分两次洗涤研钵并全部转入离心管中；10000Xg4°C下离心20min；上清夜贮于4°C冰箱中保存备测。同时称取鲜样一份（0.1g左右）烘干称重。SOD（入=560nm）试剂配制：1LPBS缓冲液中加入Met1.93973gNBT［氮蓝四唑］0.061323gEDTA-Na20.0037224g核黄素0.00075272g实验步骤：2.725mL反应液+250uL蒸馏水+25uL酶液【样品管】2.75mL反应液+250uL蒸馏水（光照作为100%CK）【照光对照管】2.75mL反应液+250uL蒸馏水（黑暗作为调零）【空白调零管】4000lx日光灯下反应20分钟，560nm比色。反应温度25~35°C。已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示按下式计算SOD活性：SOD总活性=（Ack—AE）*V/（0.5*Ack*w*Vt）（式中SOD总活性以鲜重酶单位每克表示，Ack为照光对照管的吸光度，AE为样品管的吸光度，V为样品液的总体积ml,Vt为测定时样品用量ml，w为样品鲜重g）探※※【空白调零管】可在光反应快结束前配制并用黑色纸或铝箔包裹以避光。【样品管】和【照光对照管】在光反应快结束后至测定前应避光处理。POD（入=470nm比色）试剂配制：1.5%愈创木酚（1.5ml愈创木酚，用蒸馏水定容到100ml）300uM的H202：取30%的H2O21.53ml，用蒸馏水定容到50ml；实验步骤：100ul酶液+2700ulPBS+100ul愈创木酚+100ulH2O2,于普通比色皿，轻轻摇匀2-秒，A470动力学测定1分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity,此后测定均参考该时间段。结果计算：P0D（mmol/g）二activityXAXVXa/（EXw）A反应液总体积/ml；V提取液总体积/ml；a测定液体积/ml；w材料鲜重/g；E吸光系数/mM・cmTCAT（240nm比色）试剂配制：300uM的H202:取30%的H2021.53ml，用蒸馏水定容到50ml；实验步骤：100ul酶液+2800ulPBS+100ulH2O2，于石英比色皿，轻轻摇匀2-秒，A240动力学测定1分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity,此后测定均参考该时间段。结果计算:CAT（mmol/g）=activityXAXVXa/（EXw）APX（入=290nm比色）试剂配制：7.5mM的抗坏血酸（AsA）:66mgAsA用蒸馏水定容到50ml；300uM的H202:取30%的H2021.53ml，用蒸馏水定容到50ml；实验步骤：100ul酶液+2700ulPBS+100ulAsA+100ulH2O2，于石英比色皿，轻轻摇匀2-秒，A290动力学测定1分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity,此后测定均参考该时间段。结果计算:CAT（mmol/g）=activityXAXVXa/（EXw）B.丙二醛（MDA）含量的测定（入=450,532,600nm比色）试剂配制：5%三氯乙酸（TCA）：25g三氯乙酸定容到500mL。MDA反应液：2.5g硫代巴比妥酸，先用少量1M的氢氧化钠溶解，再用5%三氯乙酸定容到500mL。实验步骤：0.5mL酶液+2.5mL反应液，沸水浴反应15分钟，立即冰浴，4800rpm离心10分钟，上清转入新管，波长450,532和600下比色，MDA反应液调零。结果计算：丙二醛含量（nmol.g-1）=（D532-D600）*A*V/（a*1.55*10-1*w）式中A为反应液总量（mL）；V为提取液总量（mL）；a为测量用提取液量（mL）；w为材料鲜重（g）。1.55X10-1为丙二醛的umol/L消光系数（nmol/mL消光系数）或者：MDA浓度（umol/L）二6.45（D532-D600）-0.56D450丙二醛含量（umol.g-1）=MDA浓度X提取液总体积（ml）/组织鲜重（g）/1000 植物体可溶性蛋白质含量测定比色原理：染料考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm,后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内(0〜100ug/ml)，蛋白质一色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。【试剂】1.65mmol/L磷酸钾缓冲液(pH；如超氧阴离子自由基含量测定用。称取K2HP04・3H20(MW=228.22)9.1234g和KH2P04(MW=136.09)3.406g，蒸馏水定容到1L。或K2HP04・3H204.562g和KH2PO41.703g，蒸馏水定容到0.5L。考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml90%乙醇中，加入85%(W/V)磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。滤纸过滤后低温储存。常温下可放置一个月；磷酸(85%，W/V):也即商业磷酸(浓度285%)。直接用。4.0.15M的NaCl(标准曲线用):NaCl0.8766g蒸馏水定容到100ml。【方法】标准曲线的绘制血清白蛋白(BSA)先用0.15M的NaCl配制成2mg/ml的原液。表1配制0〜1000ug/ml血清白蛋白液管号123456牛血清蛋白原液(ml)磷酸钾缓冲液量(ml)蛋白质含量(ug/ml)01.000.10.92000.20.84000.30.76000.40.68000.50.51000以上各管混匀后，各取0.1ml于新的10ml离心管内，各加5ml考马斯亮蓝染液，混匀放置2min，在595nm下比色，绘制标准曲线。折衷：表2配制0〜1000ug/ml血清白蛋白液管号123456牛血清蛋白原液(ul)磷酸钾缓冲液量(ul)蛋白质含量(ug/ml)01000109020020804003070600406080050501000以上各管混匀后，各加5ml考马斯亮蓝染液，混匀放置2min，在595nm下比色，绘制标准曲线。样品提取液中蛋白质浓度的测定样品制备参见超氧阴离子自由基含量测定方案。取样品上清液0.1ml于新的10ml离心管内，各加5ml考马斯亮蓝染液，混匀放置2min，在595nm下比色。结果计算样品蛋白质含量（mg/g鲜重）二C*V/W式中C—查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg/ml）；V—提取液总体积（ml）；此为样品提取液总体积为3ml；W—取样量（g）。探测定以上3项目时，同时取部分同批剩余鲜样称重后转入纸袋烘干称重。可溶蛋白.超氧阴离子自由基植物材料0.1-0.2g左右（记录准确称量值）一65mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.8） lml-少许石英砂一冰上充分研磨一转入离心管一磷酸钾缓冲液洗涤研钵2次，每次1ml全部转入离心管（样品提取液总体积为3ml）f4°C10000r/min离心15min一取上清液转入新管标记低温保存（待测液）。A.超氧阴离子自由基（入=530nm）比色原理：202.-+盐酸羟胺一N02-+磺胺一重氮化磺胺+a-萘胺一偶氮化合物（粉红色,在波长530nm处有显著的光吸收）试剂准备：1.65mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.8） ；【不用磷酸钠】称取K2HP04・3H2O（MW=228.22）9.1234g和KH2P04（MW=136.09）3.406g,蒸馏水定容到1L。或K2HP04・3H204.562g和KH2P041.703g，蒸馏水定容到0.5L。2.10mmol/L盐酸羟胺；称取盐酸羟胺(MW=69.49)0.06949g蒸馏水定容到lOOmL3.12mol/L乙酸：称取冰乙酸(MW=60.05)144.1g蒸馏水定容到200mL4.58mmol/L磺胺(12mol/L乙酸为溶剂配制)；称取磺胺(MW=172.21)0.9988g，用12mol/L乙酸溶解并定容到100mL5.7mmol/La-萘胺(12mol/L乙酸为溶剂配制)；称取a-萘胺(MW=143.19)0.100233g(O.lg)，用12mol/L乙酸溶解并定容到100mL6.三氯甲烷(氯仿)；7.NaNO2(30umol/LNaN02)(用65mmol/L磷酸钾缓冲液配制和稀释)：称取NaNO2(MW=69.00)0.207g用65mmol/L磷酸钾缓冲液定容到1L(此时NaNO2浓度3mM),从中吸取5ul,加65mmol/L磷酸钾缓冲液495ul即可(30uM)。其它25,20,15,10,5umol/LNaNO2，依此。测定流程图空白调零组：磷酸钾缓冲液0.5ml-盐酸羟胺0.1ml—摇匀一25°C水浴10min—冰浴一磷酸钾缓冲液0.5ml—摇匀f25C水浴20min—冰浴一磺胺1ml—a-萘胺1ml—摇匀一25C水浴20min—冰浴一三氯甲烷3ml—4C10000r/min离心3min—上层水相测定A530。第8页共19页试验组：磷酸钾缓冲液0.5ml-盐酸羟胺0.1ml-摇匀-25°C水浴10min-冰浴一上清液0.5ml-摇匀一25°C水浴20min—冰浴一磺胺1ml—a-萘胺1ml—摇匀一25C水浴20min—冰浴一三氯甲烷3ml—4°C10000r/min离心3min—粉红色水相（上层）测定A530。标准曲线：NaN02用65mmol/L磷酸钾缓冲液配置成30umol/L，再稀释成25,20,15,10,5和0umol/L。磷酸钾缓冲液0.5ml—盐酸羟胺0.1ml—摇匀—25C水浴10min—冰浴一加各种不同浓度的NaNO2各取0.5ml—摇匀一25C水浴20min—冰浴一磺胺1ml—a-萘胺1ml—摇匀一25C水浴20min—冰浴一三氯甲烷3ml—10000r/min离心3min—粉红色水相（上层）测定A530。结果计算：通过标准曲线生成的NO2-与A530的方程，求出[NO2-],乘2则得[0-]。0-产生速率=[02.-]/样品Pr含量/20min；02.-产生总量=[02.-]/样品Pr含量（25C水浴共培养60min）。说明：鲜样测定,不能用于干样品,样品也不宜液氮速冻后超低温冰箱储存后测定。盐酸羟胺与样品上清液的25C水浴共培养20min用于02.-产生速率测定；如果25°C水浴共培养60min则用于02.-含量测定°25C水浴共培养的时间为关键时间，必须掌握好，此步处理前后样品试剂溶液尽量处于冰浴状态。待测液制备后应尽快测定。干旱胁迫处理，要同时称量所取用的同一样品烘干至恒重称出烘干重，以便计算单位干重样品的02.-产生速率；或者用的同一新鲜样品测定蛋白质含量，以便计算单位蛋白质质量的02.-产生速率。B.可溶性蛋白质含量测定比色原理：染料考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm,后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内(0〜100ug/ml)，蛋白质一色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。【试剂】1.65mmol/L磷酸钾缓冲液(pH；如超氧阴离子自由基含量测定用。称取K2HP04・3H20(MW=228.22)9.1234g和KH2P04(MW=136.09)3.406g,蒸馏水定容到1L。或K2HP04・3H204.562g和KH2PO41.703g，蒸馏水定容到0.5L。考马斯亮蓝G-250：称取lOOmg考马斯亮蓝G-250溶于50ml90%乙醇中，加入85%(W/V)磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。滤纸过滤后低温储存。常温下可放置一个月；磷酸(85%,W/V):也即商业磷酸(浓度285%)。直接用。4.0.15M的NaCl(标准曲线用):NaCl0.8766g蒸馏水定容到100ml。【方法】标准曲线的绘制血清白蛋白(BSA)先用0.15M的NaCl配制成2mg/ml的原液。表1配制0〜1000ug/ml血清白蛋白液管号123456牛血清蛋白原液(ml)磷酸钾缓冲液量(ml)蛋白质含量(ug/ml)01.000.10.92000.20.84000.30.76000.40.68000.50.51000以上各管混匀后，各取0.1ml于新的10ml离心管内，各加5ml考马斯亮蓝染液，混匀放置2min，在595nm下比色，绘制标准曲线。折衷：表2配制0〜1000ug/ml血清白蛋白液管号123456牛血清蛋白原液(ul)磷酸钾缓冲液量（ul）蛋白质含量（ug/ml）01000109020020804003070600406080050501000以上各管混匀后，各加5ml考马斯亮蓝染液，混匀放置2min，在595nm下比色，绘制标准曲线。样品提取液中蛋白质浓度的测定样品制备参见超氧阴离子自由基含量测定方案。取样品上清液0.1ml于新的10ml离心管内，各加5ml考马斯亮蓝染液，混匀放置2min，在595nm下比色。结果计算样品蛋白质含量（mg/g鲜重）二C*V/W式中C—查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg/ml）；V—提取液总体积（ml）；此为样品提取液总体积为3ml；W—取样量（g）。探测定以上3项目时，同时取部分同批剩余鲜样称重后转入纸袋烘干称重。叶绿素.类胡萝卜素叶绿素.类胡萝卜素测量实验步骤：叶片快速剪取并精确称重0.1g左右，重复3次。再快速剪成细丝（或用打孔器打成小的叶圆片）转入洁净离心管，管内加提取液10ml，于室温下遮光静置至样品完全发白（期间多次摇动提取液），对提取液比色（以不加叶片的提取液调零），然后据提取液类型按下面公式计算叶绿素和类胡卜素含量。剪取叶片同时再精确称取0.1-0.2g左右叶片，105°C杀青10min,80°C烘干恒重后称重。结果计算：一.采用丙酮.无水乙醇.蒸馏水混合提取液(三者体积比4.5：4.5：1)Chla(mg/L)=9.784OD6634.650OD663,Chl(a+b)(mg/L)=5.134OD663+20.436OD645,Car(mg/L)=4.695OD440钛复合物黄色沉淀，可被H2S04溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H202浓度呈线性关系。【试剂】1.100umol/LH2O2丙酮试剂：取30%分析纯H20210.2ul,溶于100ml的丙酮(此时H202为1mmol/L)，混匀后从中吸取50ul再加丙酮450ul混匀(此时H202为100umol/L)。2.1mol/L硫酸：浓硫酸56ml，缓慢加蒸馏水944ml，混匀冷却。3.5%(W/V)硫酸钛：称取5g硫酸钛，加蒸馏水100ml溶解。丙酮(冰浴或冰箱预冷)；浓氨水。【方法】制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表1和2加入试剂。表1测定H202浓度标准曲线配置表试剂（ml）离心管号1234567100umol/LH2O200.10.20.40.60.81.04°C下预冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1浓氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min离心10min，弃去上清夜，留沉淀1mol/L硫酸5.05.05.05.05.05.05.0表2测定H202浓度标准曲线配置表试剂（ml）离心管号12345671mmol/LH2O200.10.20.40.60.81.04C下预冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1浓氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min离心10min，弃去上清夜，留沉淀1mol/L硫酸5.05.05.05.05.05.05.0待沉淀完全溶解后，将其小心转入新的10ml离心管中，并用蒸馏水少量多次冲洗原来的离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。（2）用移液管吸取样品提取液1ml，按表1或2加入5%硫酸钛0.1ml和浓氨水0.2ml，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min（或8000rpm离心5min），弃去上清液。沉淀用冷丙酮反复洗涤3〜5次，每次1ml（具体为：沉淀加冷丙酮1ml,混匀，8000rpm离心1min，弃掉丙酮；重复此步骤三次），直到去除植物色素。（3）向洗涤后的沉淀中加入1mol/L硫酸5ml，摇匀，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。结果计算：植物组织中H202含量（umol/gFw）=式中C样品提取液总体积（ml）；V1植物组织鲜重（g）。7.谷胱甘肽.ASAA.谷胱甘肽含量的测定还原型谷胱甘肽（GSH）是植物细胞内另一种重要的抗氧化剂。它含有活性的巯基，极易被氧化。本实验利用疏基试剂DTNB测定GSH的含量。试剂药品：GSH的提取（下面的ASA测定也使用该提取液）精确称0.2g左右叶片，将样品剪碎加入5mL10%三氯乙酸，研磨，15000Xg离心10min,留取上清液备测。同时再精确称取0.2g左右叶片，105°C杀青10min,80°C烘干恒重后称重。1.10%三氯乙酸（TCA）溶液（W/V）：10g三氯乙酸，用蒸馏水配成100mL溶液；2.150mM磷酸缓冲液（pH7.5;含有5mMEDTA）:Na2HP04・12H2038.679g和NaH2P04・2H203.952g溶于约1L水；加入EDTA使其浓度为5mM，搅匀后蒸馏水定容。3.6mMDTNB（用上面的150mMNaH2PO4（pH7.5;含有5mMEDTA）来配制）实验步骤：GSH标推曲线的制作配制浓度分别为0mM.0.02mM.0.04mM.0.06mM.0.08mM.0.10mM.0.12mM的标淮GSH溶液，吸取上述标准液各0.25mL。分别加入150mMNaH2PO4（pH7.4）2.60mL，混合均勾后，往各管中加人DTNB试剂0.15mL，摇匀厉，30°C保温反应5min，测A412nm（以加磷酸缓冲液代替DTNB试剂作空白对照）。将测定结果以GSH浓度为横坐标.光密度值为纵坐标制作标淮曲线。GSH的提取（下面的ASA测定也使用该提取液）精确称0.2g左右叶片，将样品剪碎加入5mL10%三氯乙酸，研磨，15000Xg离心10min,留取上清液备测。同时再精确称取0.2g左右叶片，105°C杀青10min,80°C烘干恒重后称重。总GSH含量的测定分别取上述样品提取液0.25mL，各加入磷酸缓冲液2.6mL.DTNB试剂0.15mL，以加磷酸缓冲液代替DTNB试剂作空白。摇匀后，于30°C保温反应5min，测定412nm波长下的光吸收值。根据标准曲线计算样品的GSH含量。折衷：分别取上述样品提取液83uL，各加入磷酸缓冲液867uL.DTNB试剂50uL于1.5ml离心管中（总体积1ml），以加磷酸缓冲液代替DTNB试剂作空白。摇匀后，于30C保温反应5min，使用微量比色皿测定412nm波长下的光吸收值。重