分子实验重点带答案

质粒DNA的构型与电泳速率的关系？质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环状DNA（超螺旋）、开环DNA（OC构型）和线性分子（L构型）。在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中跑在最前沿的是共价闭合DNA，其后依次是线性DNA和开环DNA,其原因是共价闭合的DNA其空间位阻最小，所以跑得最快。而开环DNA空间位阻最大，所以跑得最慢。碱裂解法提取质粒DNA的原理以及三种溶液的作用？碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。（简明原理：碱裂解法是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。）溶液I：溶解菌体，悬浮菌体细胞溶液II：创造碱性环境，，裂解菌体细胞使质粒缓慢释放出来，同时使质粒DNA和染色体DNA变性溶液III：恢复中性环境，使变性质粒DNA复性，感受态细胞制备过程应注意的问题；1细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5X107/ml）；2所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；5所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；挖胶过程应注意什么？电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。3）切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。如何灭活RNase？RNase灭活剂玻璃器皿200°C高温烘烤2小时塑料器皿焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液处理。常用的RNA酶抑制剂1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性从而抑制酶的活性。2、异硫氤酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3、 氧帆核糖核苷复合物：由氧化帆离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4、 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5、 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。RNAsafe含有数种特殊化合物，可使RNase失活，高效去除各种溶液或者反应缓冲液中可能存在的RNase污染，从而防止RNA的降解。提取RNA和DNA时所用的饱和酚有什么不同？提RNA时用的是水饱和酚，水饱和酚的PH小于7,一般是PH为5.0左右，通常与异硫氢酸胍一起使用，用于细胞RNA的提取，在酸性环境中，DNA在酚相，RNA在水相。两者就分开了。提DNA时用的是Tris-饱和酚，PH大于7.8，在碱性环境中DNA处于水相，RNA处于有机相。从而分离上清，即可得到DNA。如何减少蛋白诱导过程中包涵体的产生？1、 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。2、 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl[5]。3、 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。连接反应中，插入片段与载体的合适比例是多少？目的基因与载体摩尔数之比3~5：1如果插入片段较小，而载体较大，和载体的摩尔比例3-6:1连接效果好，如果载体和插入片段大小相近，摩尔比1：1较好，如果插入片段和载体的摩尔比例过大，会导致多克隆的插入。如果插入片段和载体的摩尔比例过小，会导致假阳性增多。筛选阳性克隆的方法？抗生素筛选蓝白斑筛选蓝白斑筛选的原理是什么？如果出现大量蓝斑，可能是什么原因？蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：许多载体（PUC序列）都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有P-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）。受体菌含编码。-半乳糖苷酶C端aa序列。当无外源基因插入时，载体表达的N端。-半乳糖苷酶多肽与受体菌表达的C端。-半乳糖苷酶多肽功能互补，具有。-半乳糖苷酶活性。可以将生色底物X-gal分解成蓝色物质，从而在培养基中形成蓝色菌落。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，造成插入失活，而使表达的产物不具有。-半乳糖苷酶活性，不能分解底物X-gal，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。原因：1）载体与目的基因连接做的不好，重组质粒太少，大量的自连载体进入感受态细胞。2）目的片段比较小，而且没有改变lacZ的阅读框.已知一个基因的核酸序列，如何进行蛋白表达？步骤？设计引物，PCR扩增，与T载体连接，双酶切，目的基因与表达载体连接，转化宿主细胞，IPTG诱导表达，WesternBlot分析。质粒的特点是什么？独立于细菌染色体以外的小型环状双链超螺旋DNA分子。分子的大小范围从1kb〜1000kb；质粒是一种很好的基因载体（克隆载体和表达载体）。能独立复制并稳定保存。具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。质粒对宿主的生存并不是必需的。13.PCR的原理是什么？PCR程序通常有哪几个步骤？聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是模拟体内DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。步骤PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93r左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55^左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2〜4分钟，2〜3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍14.当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？答：要避免星活性及部分酶切。（1）先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶；（2）用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将DNA重新溶解与适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化；（3）先低温酶，后高温酶；（4）使用通用缓冲液。15.大肠杆菌转化（CaCl2法）的原理？其原理是细菌处于0°C，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42C短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5X106〜2X107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。感受态细胞制备及转化中的影响因素？⑴、细胞的生长状态和密度最好从-70°C或-20°C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4。。的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5X107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0.5时，细胞密度在5X107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。⑵、质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。⑶、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4C。⑷、防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，低温的主要目的是什么？热休克温度和目的是什么？低温目的：抑制细胞的旺盛的生理代谢有助于DNA-Ca2+吸附于细胞表面防止DNAase降解DNA热休克休温度是42°C；目的是使细胞摄入吸附于其表面的DNA。影响PCR扩增的因素有那些？引物的质量与特异性；2PCR循环条件（退火温度）Mg2+浓度；模板DNA的质量；5酶的质量。引物设计的基本原则？引物长度一般在18〜25碱基之间。避免引物内和引物之间的二级结构两个引物的Tm值要接近。G+C含量在40%〜60%之间，避开局部富含GC或AT,3’端避开ATrich结构碱基要随机分布。引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，特别是3’末端的3个碱基。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。引物5'端可以修饰，引物3'端不可修饰。SDS-PAGE的原理？SDS是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象。蛋白质分子与SDS充分结合。PAGE聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bi）在加速剂NNN'N'-四甲基乙二胺（简称TEMED）和催化剂过硫酸铵（简称AP）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。SDS-PAGE电泳的速率为什么只与蛋白的分子量有关，而与所带电荷多少无关？蛋白质分子与SDS充分结合后，所带的SDS的负电荷远远大于蛋白质本身的电荷量，因而就掩蔽或消除了不同种类蛋白质分子间的电荷差异对电泳迁移率的影响。电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量。提取RNA过程中，怎样才能有效地降低材料本身给RNA提取带来的降解？1、新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。2、 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品（如肝脏，胸腺等），即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是:在液氮条件下将组织研碎并且匀浆时使用更多裂解液下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。3、 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70'C冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70C冰箱中。冷冻样品，保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于70C冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后在液氮刚刚挥发完时将样品迅速转移到含裂解液的容器中品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中立即混匀匀浆。4、 外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系4、外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。5、 内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高异硫氤酸胍法提取RNA的原理？异硫氤酸胍可以裂解细胞释放出核酸，并同时使蛋白质变性，抑制内源的RNase活性。在酸性条件下（NaAc）溶于水相而溶于有机相这样