丙泊酚对体外培养发育期海马神经元的神经毒性作用及机制研究

丙泊酚对体外培养发育期海马神经元的神经毒性作用及机制研究第一部分原代大鼠海马神经元的培养、鉴定及形态学观察目的：通过对新生24h内SD乳鼠海马神经元的培养，掌握大鼠海马神经元体外培养方法；利用免疫荧光细胞化学方法鉴定神经元纯度；观察原代海马神经元形态学特点，测定细胞生长曲线。方法：取新生24h内的SD乳鼠，用75%乙醇消毒，断头，无菌条件下分层剪开皮肤和颅骨，暴露两侧大脑半球，弯镊取出大脑，置于预冷的DMEM液中，迅速分离出两侧海马组织，在解剖显微镜下去除血管和被膜，移入溶有木瓜酶的DMEM中，置于培养箱(37°C,5%CO2)中消化30min。用玻璃吸管将组织块移入加有10%血清的DMEM液中终止消化两次，每次2min。然后将组织块移入加有血清的DMEM液中，用进口枪头轻轻吹打数次，静置后取上清液，如此重复2次。取0.9ml按台盼蓝拒染法进行活细胞计数，制成密度为1×106/ml的细胞悬液,种植于基膜包被的24孔培养板中，每孔加150μl，置于37°C，5％CO2的培养箱内培养。4～6h后在倒置相差显微镜下观察神经细胞生长情况，全量换含有1%N2、2%B27的Neurobasal培养液。此后每2d半量换液，并在倒置相差显微镜下观察神经元生长情况。神经元培养7d后，4%PFA固定，0.3%Triton透膜，10%BSA封闭后滴加一抗β-Tubulin抗体(1:200稀释)，4°C孵育过夜，加2%BSA稀释的Dylight488标记的二抗，37°C孵育2h。10μg/ml的Hoechst33258复染细胞核，避光孵育20min。荧光显微镜下观察。在高倍视野(×200)下随机选取5个视野，计数阳性细胞数，换算为百分比，取均值作为神经元纯度。将细胞接种于96孔板，每隔两天测吸光度值，共测8次得出生长曲线。结果:1刚刚接种的细胞形态为圆形，体积小、透亮、呈悬浮状态，单个均匀分布，培养4～6h后细胞已贴壁，呈圆形或椭圆形，已有细胞出现突起，少量细胞呈梭形。接种24h，细胞形态多呈梭形、三角形、椎体形，突起伸长，长短不一。接种48h，细胞多出现2～3个突起，且突起较长，扁平状多边形的神经胶质细胞数量较少。3d后细胞具有典型神经元形态，细胞突起增多伸长。5d后神经元开始形成神经元群落，突起已经形成比较稠密的纤维网络。7～10d神经元胞体最丰满，具有明显的光晕，突起相互交织成更加密集的网络。14d后细胞聚集现象较为明显，培养板上出现的细胞间空白区域明显。之后神经细胞逐渐退化，细胞边缘光晕变浅变淡，突起逐渐退缩，部分细胞核具有明显的固缩。2原代培养神经元形态典型，突起连接成网，细胞核染色清晰，β-TubulinⅢ阳性神经元所占比例为(91.21±0.02)%，能够满足进一步的实验要求。3原代海马神经元生长曲线测定显示，海马神经元体外培养条件下经历了生长潜伏期(2～4d)，对数生长期(4～12d)，后进入生长平台和衰退期，细胞生长处于停滞和衰退状态。结论：1原代SD新生乳鼠海马神经元，在培养10d后细胞形态逐渐成熟。在倒置相差显微镜下形态呈梭形、三角形、锥体形。2原代培养的神经元免疫荧光染色为β-tublinⅢ阳性细胞，其纯度为(91.21±0.02)%。3原代海马神经元的培养经历了一个生长潜伏期、对数生长期、生长平台期和衰退期。第二部分丙泊酚对发育期海马神经元活力和凋亡的影响目的：通过给予不同浓度的丙泊酚培养神经元不同的时间后，采用MTT法测定丙泊酚对发育期的海马神经元的活性影响；采用流式细胞技术测定不同浓度的丙泊酚培养24h对海马神经细胞凋亡率和周期的影响；采用Hoechst33258染色观察神经元的凋亡情况。方法：取原代培养4～5d的海马神经元，分别加入10μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml不同浓度的丙泊酚，作用12、24、48、72h后，测量MTT值。每次实验均设原代培养基作为空白对照组。细胞活力=(实验组-空白组)/(对照组-空白组)。根据MTT所得结果，在6孔板培养海马神经元4～5d，加入40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml不同浓度丙泊酚，继续培养24h，收集细胞标本，通过流式细胞技术检测海马神经元的凋亡和周期；Hoechst33258染色测定凋亡，细胞培养同流式检测，其分组同MTT检测各组。结果：1MTT法检测细胞活力结果表明，丙泊酚对海马神经元活力的影响具有浓度和时间的交互作用(F=11.116,P<0.01)。当给药浓度相同时，丙泊酚作用海马神经元不同的时间，对其活力的影响具有显著性差异(F=18.565,P<0.01)，其中丙泊酚在处理12h和48h后无显著性差异。当作用时间相同时，不同浓度的丙泊酚对细胞活力的影响具有显著性差异(F=889.074,P<0.01)，与对照组相比10μg/ml丙泊酚在各个作用时间上均无显著性差异。2流式细胞技术检测凋亡率表明，各浓度丙泊酚处理海马神经元24h对其凋亡率的影响具有显著性差异（F=76.577,P<0.01）。各浓度丙泊酚与对照组相比，均有统计学差异，且随浓度的增加神经元凋亡率增加。流式细胞技术检测细胞周期结果表明，不同浓度丙泊酚作用于海马神经元24h对细胞周期的G0/G1期和S期的影响具有显著性差异（F=138.456,P<0.01;F=114.158,P<0.01），40、60、80μg/ml浓度均有统计学差异。随着丙泊酚作用浓度的增加，G0/G1期的细胞比率逐渐下降，S期的细胞比率逐渐增高，G2/M期细胞比率在所有组别中有统计学差异（F=14.131,P<0.01），40、60μg/ml与对照组相比无统计学差异。3Hoechst33258荧光染色细胞核表明随着丙泊酚浓度的增加，细胞核变形，呈折缝样或呈波纹状的细胞核逐渐增多，部分染色质凝聚、边缘化，100μg/ml时细胞数明显减少，细胞核甚至裂解成碎块。结论：丙泊酚对发育期海马神经元活力具有抑制作用且呈时间和浓度依赖性，两者有交互性。不同浓度丙泊酚对发育期海马神经元的凋亡率的影响显著，且随浓度的增加而增加，而且可促进发育期海马神经元由G0/G1期进入S期，但不能进入G2/M期，细胞增殖停滞于S期。第三部分Rho信号通路在丙泊酚致发育期海马神经元毒性中的作用目的：采用RT-PCR技术检测Rho信号通路在丙泊酚神经毒性中的作用。方法：取原代培养4～5d海马神经元进行实验，分为对照组、80μg/ml丙泊酚处理组、80μg/ml丙泊酚加10μMY27632混合组、10μMY27632组，即C组、P组、P+Y组和Y组，培养时间为24h。利用RT-PCR技术分析各实验组RhoA、Rac1、CDC42和PAK1表达的改变。结果：RT-PCR分析显示：P组与C组相比RhoA的表达明显增高（P<0.01），RAC1、PAK1表达明显降低（P<0.01），CDC42降低（P<0.05）；P+Y组与P组相比RhoA的表达明显降低（P<0.01），CDC42表达明显升高（P<0.01），RAC1、PAK1的表达增高，但无统计学差异；P+Y组与Y组相比RhoA的表达明显升高（P<0.01），RA