发酵工程 4 发酵工业无菌技术

4发酵工业的无菌技术思索题1、发酵工业中污染杂菌的危害及其预防措施2、灭菌、消毒、除菌与防腐3、灭菌的常用方法及其机理4、湿热灭菌的实际计算5、空气灭菌的常用方法6、简述好氧发酵无菌空气制备的工艺流程与要求。什么是染菌？发酵过程中除了消费菌以外，还有其它菌生长繁衍。一、发酵工业的无菌处置灭菌〔sterilization〕是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。灭菌本质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者那么指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消逝的景象。消毒〔disinfection〕是指用化学或物理的方法杀灭或去除病原微生物的过程，它普通只能杀死营养细胞而不能杀灭细菌芽孢。消毒是一种采用较温暖的理化要素，仅杀死物体外表或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体根本无害的措施。除菌〔degerming〕是用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。防腐〔antisepsis〕就是利用某种理化要素完全抑制霉腐微生物的生长繁衍，从而到达防止食品等发生霉腐的措施。如低温、缺氧、枯燥、高渗、添加防腐剂等。1〕由于杂菌污染，使发酵培育基因杂菌的耗费而损失，呵斥产率的下降；2〕由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后发酵液某些理化性质的改动，使产物的提取变得困难，呵斥得率降低或使产质量量下降；3〕污染的杂菌能够会分解产物而使消费失败；二、杂菌污染的危害4〕污染的杂菌大量繁衍，会改动反响介质的pH，从而使生物化学反响发生异常变化；5〕发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使消费失败等。三、发酵污染及其危害的详细分析1、染菌对不同菌种发酵的影响细菌：发酵周期短，主要防止噬菌体的污染；营养缺陷型细菌：生长才干差，所需培育基营养丰富，易受生长较快杂菌的污染；霉菌：发酵周期较长，易染菌。对于有机酸发酵，中、后期pH较低不易发生染菌；酵母：易受生长较快的细菌及野生酵母的污染。放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌那么可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。不同产品链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会呵斥不同程度的危害。如杂菌大量耗费营养干扰消费菌的正常代谢；改动pH，降低产量。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。不同产品对疫苗消费危害很大。如今疫苗多采用深层培育，这是一类不加提纯而直接运用的产品，在其深层培育过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。2、污染不同种类和性质的微生物的影响〔1〕污染噬菌体噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的呵斥断种，被迫停产。〔2〕污染其它杂菌有些杂菌会使消费菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。由于接种量较小，消费菌生长一开场不占优势，而且培育基营养丰富，容易污染杂菌。种子染菌对发酵危害极大，应严厉控制种子染菌，如在此阶段染菌，应将培育液全部废弃。3、不同发酵时期染菌对发酵的影响〔1〕种子培育期染菌〔2〕发酵前期染菌发酵前期最易染菌。缘由发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物〔抗生素〕或产生很少，抵御杂菌才干弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。措施可以用降低培育温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培育周期等措施予以补救。假设前期染菌，且培育基养料耗费不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。发酵中期染菌，处置困难，危害很大。〔3〕发酵中期染菌发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培育液pH下降；糖、氮耗费快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停顿，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施降温培育，减少补料，亲密留意代谢变化情况。假设发酵单位到达一定程度可以提早放罐，或者抗生素消费中可以将高单位的发酵液保送一部分到染菌罐，抑制杂菌。〔4〕发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭才干。因此假设染菌不多，对消费影响不大。假设染菌严重，又破坏性较大，可以提早放罐。4、杂菌污染对发酵产物提取和产质量量的影响1〕发酵染菌对过滤的影响染菌的发酵液普通发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难构成滤饼，导致过滤困难。污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差别，如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转运用，破坏了消费平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率，直接影响提取总收率。2〕发酵染菌对提取的影响染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。采用有机溶剂萃取的提炼工艺，那么极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分别，影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂外表，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一同进入洗脱液，影响进一步提纯。四、杂菌污染的防治1、染菌的检查显微镜检查法：平板划线培育检查法：肉汤培育检查法：发酵过程的异常景象察看法：溶解氧、pH、尾气中的CO2含量、发酵液黏度、颜色等的异常变化，都能够是发生染菌的重要信息。溶解氧程度的异常变化污染好氧性杂菌，溶解氧在短时间内下降，并接近零值，长时间不能上升；污染非好氧性杂菌，消费菌遭到抑制，耗氧量减少，溶解氧升高。pH异常对于污染产酸菌或利用碳源效率高生长较快的杂菌，会使pH迅速下降。尾气中CO2含量异常污染杂菌，糖耗加快，CO2含量添加；感染噬菌体，糖耗减慢，CO2含量减少。2、污染的缘由分析染菌的缘由复杂，包括种子带菌、空气带菌、设备渗漏、培育基或补料液灭菌不彻底、操作失误、技术管理不善等。日本工业技术院发酵研讨所多年来抗生素发酵染菌缘由分析工程百分率%种子带菌或疑心种子带菌9.64接种时罐压跌零0.19培育基灭菌不透0.79总空气系统有菌19.96泡沫冒顶0.48夹套穿孔12.36盘管穿孔5.89接种管穿孔0.39阀门渗漏1.45搅拌轴密封渗漏2.09罐盖漏1.54其它设备渗漏10.13操作缘由10.15缘由不明24.941〕从污染杂菌的种类分析污染耐热芽孢杆菌：培育基或设备灭菌不彻底；污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、设备渗漏或操作问题；污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。2〕从污染时间分析发酵前期染菌：种子带菌、培育基或设备灭菌不彻底、操作不当或空气带菌；发酵后期染菌：中间补料污染、设备渗漏或操作问题。3〕从染菌程度分析多个罐染菌：种子带菌、空气系统问题；个别罐染菌：设备问题、操作不当。3、杂菌污染的途径及其预防措施1〕种子带菌种子带菌又分为种子本身带菌和种子培育过程中染菌。加强种子管理，严厉无菌操作，种子本身带菌是可以抑制的。种子培育过程染菌与发酵一样有许多要素呵斥。防止种子带菌制备种子时对沙土管及摇瓶严厉加以控制。沙土制备时要多次间歇灭菌留意接种时的无菌操作子瓶、母瓶的移种和培育无菌室和摇床间都要坚持清洁。无菌室内要供应恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌。无菌室要求在无菌室中装有紫外灯，翻开紫外灯，照半小时，关灯后15分钟再接种。用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、拖地，开启超净台的通风，接种时必需在超净台上操作，超净台装有一台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不能够进入接种区域，保证无菌条件。接种人员必需穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干净。2〕空气带菌从日本工业技术院分析空气带菌而呵斥的染菌为19.96％。国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但依然没有使染菌率降低到理想的程度。由于空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。防止空气引起的染菌空气过滤除菌设备流程空压机储罐二级冷却加热器空气过滤器粗过滤空气冷却器的列管穿孔泄露，冷却水会渗入到空气中，呵斥染菌。棉花-活性炭过滤器长期运用后，棉花和活性炭的体积被紧缩而松动，假设上下端棉花铺得厚薄不均，厚的一边阻力大空气不畅通，薄的一边空气容易经过，久而久之，薄的一边长期受空气顶吹而使棉花活性炭改动位置，呵斥过滤器失效。过滤器用蒸汽灭菌时，假设被蒸汽冷凝水润湿就会降低或丧失过滤效能，灭菌终了应立刻缓慢通入紧缩空气，将水分吹干。3〕设备渗漏设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研讨所对染菌缘由分析发现，这类染菌占33.85％。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。防止设备渗漏发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦呵斥机械磨损以及加工制造不良等缘由会导致设备及附件渗漏。设备上一旦渗漏，就会呵斥染菌，例如冷却盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会经过漏孔而进入发酵罐中招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而呵斥染菌。设备上的漏隙假设肉眼能看见，容易发现，也容易治理；但有的微小走漏，肉眼看不见，必需经过一定的试漏方法才干发现。试漏方法可采用水压试漏法。即被测设备的出口处装上压力表，将水压入设备，待设备中压力上升到要求压力，封锁进出水，看压力有否下降。压力下降那么有渗漏。但有些渗漏很小，看不出何处漏水，可以用稀碱溶液压入设备，然后用蘸有酚酞的纱布揩，只需酚酞能变红处即为渗漏处。阀门渗漏可以用集气桶来试漏。方法是先在集气桶中装满水，然后封锁一切阀门，向发酵罐中通入空气，使罐压上升到要求压力，普通一公斤以上。由于集气桶连通各管道，察看哪根管子冒泡，即这根管子的阀门漏气。4〕灭菌不彻底灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系蒸汽通入培育基。升温快慢、保温时间、泡沫的产生；蒸汽总压能否到达要求规范环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。如上海第四制药厂在卡那霉素消费中，于炎热的夏季将延续灭菌预热至800C的培育基采样培育，可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培育中，那么仅发现2～3个芽孢杆菌。原资料储存和保管，如液胨、玉米浆、母液糖等有机原料——杂菌的数量发酵罐、培育基配制罐等设备的清洗质量——有无灭菌的死角对减少或防止染菌依然是非常必要的。五、发酵工业的无菌技术1．化学试剂灭菌法：常用试剂有甲醛、氯气〔或次氯酸钠〕、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐〔如新洁尔灭〕、臭氧等。这些物质易与微生物细胞中的一些成分产生化学反响，如使蛋白量变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性而杀灭微生物。由于化学试剂也会与培育基中的一些成分作用，而且参与培育基后不易去除，它不能用于培育基的灭菌，但染菌后的培育基可用化学药剂处置。2．辐射灭菌：利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。如紫外线〔穿透力低，仅适用于外表消毒和空气消毒〕与菌体核酸的光化学反响而使菌体死亡；〔0.01-0.14nm〕的X射线、Co60产生的γ射线，它们含极高的能量，可使菌体内的水和有机物产生剧烈的离子化反响，构成OH-、H2O2和有机过氧化物，从而在微生物体内引起氧化连锁反响，导致微生物菌体迅速死亡。近年兴起了微波灭菌。3．过滤除菌法适用于廓清液体和气体的除菌。是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而到达除菌目的。用于遇热容易变性而失效的试剂或培育液。4．高温灭菌法：1〕干热灭菌法160℃下保温1-2小时。干热对微生物有氧化、使细胞蛋白量变性和电解质浓缩等效应而使菌体死亡。2〕火焰灭菌法灭菌彻底，但仅适用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。3〕湿热灭菌法(工业上的蒸气灭菌安装)：湿热灭菌要比干热灭菌更有效，这一方面是由于湿热易于传送热量，蒸汽具有很强的穿透才干，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，另一方面是由于湿热更易破坏坚持蛋白质稳定性的氢键等构造，从而加速其变性。很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。普通的湿热灭菌条件：121℃，30min。高压蒸汽灭菌是发酵工业最常用的方法，能有效地杀灭杂菌，但高温也破坏培育基的营养成分。消除高温有害影响的措施〔1〕对易破坏的含糖培育基进展灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；〔2〕对含Ca2+或Fe3+的培育基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易构成磷酸盐沉淀；〔3〕对含有在高温下易破坏成分的培育基〔如含糖组合培育基〕可进展低压灭菌〔在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下灭菌15分钟〕或间歇灭菌；〔4〕在大规模发酵工业中，可采用延续加压灭菌法进展培育基的灭菌。4)间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培育基的灭菌。方法是：将待灭菌的培育基在80～100℃下蒸煮15～60分钟，以杀死其中一切微生物的营养细胞，然后置室温或37℃下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此延续反复3天，即可在较低温度下到达彻底灭菌的效果。灭菌设备

高压蒸汽灭菌

消费中运用高压蒸汽灭菌锅的型号很多：手提式灭菌锅立式或卧式灭菌锅大型灭菌锅六、发酵培育基与设备管道灭菌某些分子的分解和分子内部的重新陈列的反响属于单分子反响。杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热被杀死，主要缘由是高温能使蛋白量变性，这种反响属与单分子反响，因此杂菌在一定温度下受热死亡也遵照单分子反响方程。1、湿热灭菌原理对微生物进展湿热灭菌时，培育基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，即式中，N为培育基中活微生物的个数；t为微生物受热时间；k为比死亡速率。假设开场灭菌时〔t＝0〕，培育基中活微生物数为N0，将上式积分可得即随温度的变化，比死亡速率k值有很大的变化，温度对k的影响遵照阿仑尼乌斯定律。或A－阿累尼乌斯常数，1/s，对指定反响来说为一常数；E－反响的活化能；R－摩尔气体常数；T－热力学温度。由实验测得一微生物死亡反响在一系列不同温度时的k值，以对作图，可得不断线。直线的斜率为，截距为，可求得该反响的活化能。培育基在灭菌以前，存在各种各样的微生物，它们的k各不一样，k值越小，那么此微生物越耐热。在计算时，可以对热抵抗力较大的芽孢杆菌的k进展计算，这时A可以取1.34×1036s-1，E可以取2.844×105J/mol，这样得到了只随灭菌温度而变的灭菌速率常数k的简化计算公式，即假设要求灭菌后绝对无菌，即N=0，那么从上面公式可以看出灭菌时间t将等于无穷大，这是不能够的，故培育液灭菌后，以在培育液中还残留一定活菌数进展计算。工程上，通常以=10-3个/罐，即杂菌污染降低到被处置的每1000罐中只残留1个活菌的程度，此数已满足消费要求。某发酵罐，内装培育基80m3，在121℃下进展分批灭菌。设每毫升培育基中含耐热的芽孢为107个，求灭菌时间？影响培育基灭菌的要素1〕pH值的影响pH值对微生物的耐热性影响很大，pH为6.0－8.0时微生物最不易死亡，pH<6.0时氢离子易渗入微生物的细胞内。2〕培育基成分培育基的成分中，油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质，会添加微生物的耐热性，使灭菌困难。浓度较高的培育基相对需求较高温度和较长时间灭菌。高浓度的盐类，色素那么减弱其耐热性，故较易灭菌。3〕培育基中的颗粒物质培育基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。普通说来，含有颗粒对培育基灭菌影响不大，但在培育基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必需过滤除去。2、分批灭菌培育基的分批灭菌就是将配制好的培育基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培育基和所用设备一同灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。在工业上，培育基的分批灭菌无需专门的灭菌设备，设备投资少，灭菌效果可靠，对灭菌用蒸汽要求低〔0.2-0.3Mpa表压〕，但因其灭菌温度低、时间长而对培育基成分破坏大，对操作难于实现自动控制。分批灭菌的过程包括升温、保温暖降温三个阶段。1〕培育基的预热灭菌时培育基需经过夹套或蛇管先加热到80－90℃，然后再导入蒸汽升温至120－130℃。预热的目的一是防止直接导入蒸汽时由于培育基与蒸汽的温差过大而产生大量冷凝水使培育基稀释；二是防止直接导入蒸汽所呵斥的泡沫急剧上升而引起物料外溢。2〕培育基灭菌将蒸汽从进气口、排料口或取样口直接导入罐内，使罐温上升至120－130℃，并保温30min。3〕降温封锁蒸汽，先自然冷却10分钟左右，通冷却水进展冷却，当罐内温度降至70℃以下时，启动搅拌桨搅拌，慢速搅动培育基，加速冷却。当蒸汽阀门封锁以及通冷却水后，发酵罐的罐压将迅速下降，当罐内压力降至0.03MPa时，必需间隙开启进气阀，让无菌空气进入发酵罐内，并使罐压坚持在0.03-0.05MPa之间，以罐内产生负压而吸入外界空气。在引入无菌空气前，罐内压力必需低于空气压力，否那么罐内物料〔培育基〕将倒流进展空气过滤器。灭菌时总蒸汽压力不低于0.3-0.4Mpa，运用压力不低于0.2Mpa。应该指出，在分批灭菌时，升温阶段对灭菌亦是有奉献的。3、培育基的延续灭菌延续灭菌就是将配制好的培育基在通入发酵罐时进展加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。延续灭菌时，培育基在短时间内被加热到灭菌温度〔普通为130-140度〕，短时间保温〔普通为5-8min〕后，被快速冷却，再进入早已灭菌终了的发酵罐。组成培育基的不同成分〔耐热与不耐热、糖与氮源〕可在不同温度下分开灭菌，以减少培育基受热破坏的程度。培育基的延续灭菌具有对培育基破坏小、可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率、蒸汽用量平稳等优点而被广泛运用，尤其在培育基体积较大时。但对加热蒸汽的压力要求较高，普通不小于0.45Mpa。同时延续灭菌需求一组附加设备，设备投资大。培育基连消工艺流程图分批灭菌与延续灭菌的比较灭菌方式

优点

缺陷

延续灭菌

1、灭菌温度高，可减少培育基中营养物质的损失；

2、操作条件恒定，灭菌质量稳定；

3、易于实现管道化和自控操作；

4、防止了反复的加热和冷却，提高了热的利用率；

5、发酵设备利用率高；

1、对设备的要求高，需另外设置加热冷却安装；

2、操作较费事；

3、染菌的时机多；

4、不适宜于含大量固体物料的灭菌；

5、对蒸汽的要求高；

分批灭菌

1、设备要求低，不需另外的加热冷却装置；

2、操作要求低，适于手动操作；

3、适宜于小批量消费规模；

4、适宜于含有大量固体物质的培育基的灭菌；

1、培育基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降；

2、需进展反复的加热和冷却，能耗较高；

3、不适宜于大规模消费过程的灭菌；

4、发酵罐的利用率较低；

七、空气除菌好气性发酵过程中需求大量的无菌空气，空气要作到绝对无菌在目前是不能够的，也是不经济的。发酵对无菌空气的要求是：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项目的；发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只需在