表皮葡萄球菌聚集相关蛋白(Aap)作为抗细菌生物膜疫苗候选抗原的研究

表皮葡萄球菌聚集相关蛋白（Aap）作为抗细菌生物膜疫苗候选抗原的研究凝固酶阴性的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)为人体皮肤表面常见的共生菌,通常不致病。但近年来随着各种植入性医疗材料的广泛使用,表皮葡萄球菌已成为院内感染的主要条件致病菌,主要原因是其能在这些医疗材料表面形成生物膜(biofilm)结构,该结构能够很好地保护细菌抵抗多种抗生素的治疗和人体免疫系统的攻击,并从中不断释放细菌,从而造成机体的反复感染,最终将导致医疗材料植入的失败,对患者造成极大的痛苦和对社会造成巨大的经济损失。此外,由于抗生素的大量使用导致表皮葡萄球菌多重耐药株的发生率日趋增高,因此急需开发预防和治疗葡萄球菌感染的新方法,尤其是开发能够有效抗表皮葡萄球菌生物膜的疫苗。细菌生物膜是细菌粘附在有机或无机材质表面形成的由细菌及大量细胞外粘附分子组成的多层细菌菌落结构。表皮葡萄球菌生物膜的形成主要分为三个阶段,初始粘附、增殖聚集及生物膜成熟。在生物膜形成的初始粘附阶段,细菌通过大量粘附分子(Adhesin)直接或间接粘附于医疗材料的表面。当完成初始粘附后,细菌在大量分裂增殖的同时,开始以细菌表面或分泌至细胞外的多种粘附分子为介导,相互粘附并聚集形成一种多层的细菌群落结构。最终,当大量细菌聚集并在医疗材料表面形成生物膜后,生物膜表面的细菌开始从生物膜上脱落,并随生物膜外的体液播散至其他部位进而形成新的生物膜。由于在表皮葡萄球菌生物膜形成的过程中,众多的粘附分子对细菌的粘附和聚集起到了十分重要的作用,因此研究上述细菌粘附分子在生物膜形成中的作用,并研究粘附分子的特异性抗体对细菌粘附聚集能力和生物膜形成能力的影响,便能为抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗的研发奠定基础。在表皮葡萄球菌生物膜形成的过程当中,现发现的能够介导细菌间相互粘附聚集的粘附分子主要有三大类,多糖细胞间粘附因子(PIA)、蛋白粘附因子、以及细胞外DNA(eDNA)。在这三类粘附分子中,Aap蛋白是一种表达于表皮葡萄球菌细胞壁表面的重要的蛋白粘附分子。Aap蛋白介导的细菌间相互粘附聚集主要是通过其A结构域被蛋白酶水解后,其B结构域在Zn2+存在条件下发生同源二聚化而实现的。已有文献报道,针对Aap蛋白的抗体可以有效抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成,因此提示Aap蛋白很可能成为抗表皮葡萄球菌生物膜的候选疫苗。本课题目的是以表皮葡萄球菌Aap蛋白为研究对象,研究其介导表皮葡萄球菌粘附聚集及生物膜形成的关键结构域,并通过详细研究其单克隆抗体对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响综合分析评价Aap蛋白作为抗生物膜疫苗候选抗原的可能性,同时确定Aap蛋白诱导抗生物膜抗体产生的抗原表位,从而为丌发新型的抗葡萄球菌感染的疫苗奠定理论和实践基础。第一章表皮葡萄球菌Aap蛋白介导细菌生物膜形成关键结构域基本功能单位的确定在表皮葡萄球菌生物膜形成的过程中,Aap蛋白介导的细菌间相互粘附聚集发挥了极为关键的作用,针对Aap蛋白的抗体可以明显抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成,因此Aap蛋白可以作为抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗的候选抗原。然而因Aap蛋白分子量较大(140-300kDa),所以利用大肠杆菌原核重组表达全长的Aap蛋白难以实现较高的蛋白产量,导致很难利用全长Aap蛋白制备疫苗；同时由于Aap蛋白是表皮葡萄球菌中的一种优势抗原,直接运用这种来源于细菌的大分子蛋白制备的疫苗安全性较低,难以用于人体的全身免疫。基于上述原因,利用Aap蛋白作为抗原研发相关的疫苗产品,只能在Aap蛋白中寻找其介导细菌间相互粘附聚集和生物膜形成的关键区域,并且以该区域为抗原进一步研究其是否能够诱导动物产生抗生物膜的抗体,从而为后续的疫苗研发奠定基础。通过对Aap蛋白的生物信息学分析,我们发现Aap蛋白由N端信号肽、A结构域、B结构域、P/G富集结构域和C端的LPXTG细胞壁锚链基序组成。在不同的表皮葡萄球菌菌株中,由高度保守的重复元件反复重复串联构成的B结构域是Aap蛋白中变异最大的区域,不同菌株Aap蛋白该区域含有的重复元件数量不同,RP62A、ATCC12228和5179株Aap蛋白的B结构域分别含有12个、6个和5个重复元件。利用穿梭质粒pCN51在肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)中过表达表皮葡萄球菌ATCC12228株Aap蛋白的B结构域,原本不能形成生物膜的肉葡萄球菌形成了较为明显的细菌生物膜。说明ATCC12228株Aap蛋白B结构域可以介导细菌生物膜的形成,即使其含有重复元件的数量不同于生物膜形成阳性菌株RP62A或5179株Aap蛋白B结构域中含有重复元件的数量。该结果提示,Aap蛋白B结构域正确空间构象的形成及其介导细菌粘附聚集的功能同其含有的重复元件的数量没有相关性,各重复元件可能独立行使功能。进一步克隆、表达、纯化“Aap蛋白B结构域最后一个重复元件及其后的不完整重复元件”,即AapBrpt1.5后,利用Native和生物膜微孔板半定量实验分别研究AapBrpt1.5的聚合状态及其对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响。AapBrpt1.5在Zn2＋的介导下可以发生多聚化,同时AapBrpt1.5还可以竞争性抑制表皮葡萄球菌RP62A株生物膜的形成(抑制作用和浓度成正比)。因此我们认为,B结构域中的每个重复元件都是一个可以在Zn2＋介导下发生多聚化的独立区域,AapBrpt1.5是Aap蛋白介导细菌间相互粘附聚集和生物膜形成的基本功能单位。此外,通过AapBrpt1.5免疫小鼠得到免疫血清后,利用激光共聚焦显微镜观察了小鼠免疫血清对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响。抗AapBrpt1.5小鼠血清可以明显抑制表皮葡萄球菌RP62A株生物膜的形成。AapBrpt1.5作为Aap蛋白介导细菌生物膜形成的基本功能单位,可以代替全长的Aap蛋白作为一个合适的抗原而用于后续的抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗的研发。第二章表皮葡萄球菌Aap蛋白诱导抗生物膜抗体产生的抗原表位确定既往研究证明,Aap蛋白在表皮葡萄球菌生物膜形成过程中具有非常重要的作用,并且其抗体可以抑制细菌生物膜的形成,提示Aap蛋白可以作为抗生物膜的候选疫苗。但是由于全长Aap蛋白的抗原性过强、分子量过大,限制了其作为疫苗的应用前景。随着单克隆抗体技术和抗原表位测定技术的发展,为在Aap蛋白中寻找能够诱导动物产生抗生物膜抗体的抗原表位提供了有力的条件。这种抗原表位的多肽很有可能成为最佳的抗生物膜的候选疫苗。基于此目的,我们研究了小鼠抗Aap单克隆抗体对表皮葡萄球菌聚集能力和生物膜形成的影响,并测定了各单克隆抗体的抗原表位,为基于该表位的抗生物膜表位多肽疫苗的研发奠定了基础。首先,利用Aap蛋白介导生物膜形成的基本功能单位AapBrpt1.5作为抗原,我们制备了小鼠抗Aap单克隆抗体：MAb18B6、MAb25C11和MAb20B9。利用ELISA和WesternBlot分别检测各抗体的效价及抗原识别力等免疫反应性,3株单克隆抗体(IgG)对AapBrpt1.5具有很高的抗原亲和力(效价≥1：1280000/0.4mg/mL),同时3株单克隆抗体都可以与表皮葡萄球菌(RP62A和ATCC12228株)Aap蛋白发生特异性结合。利用蛋白截短联合免疫共沉淀法对3株单克隆抗体抗原表位的测定表明,MAb18B6位于AapBrpt1.5中抗原识别位点的序列与表皮葡萄球菌RP62A株Aap蛋白B结构域各重复元件中相应位点的序列完全一致；而MAb25C11和MAb20B9的抗原表位序列仅与RP62A株Aap蛋白B结构域中部分重复元件相应位点的序列完全一致,而在其他重复元件中的相应位置存在有氨基酸残基的变异。继而,利用生物膜微孔板半定量实验和激光共聚焦显微镜研究小鼠抗Aap单克隆抗体对表皮葡萄球菌生物膜形成和细菌聚集状态的影响,MAb18B6可以抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成(抑制率≤40%),但是MAb25C11和MAb20B9却可以促进细菌生物膜的形成(促进率≤30%)。此外,3株单克隆抗体都可以促使浮游生长的表皮葡萄球菌发生较为明显的聚集并形成细菌团块。结合对3株单克隆抗体抗原表位测定的结果,我们认为不同单克隆抗体对细菌生物膜形成的影响同其识别的抗原表位有关。MAb18B6抗原表位位于表皮葡萄球菌RP62A株Aap蛋白B结构域重复元件中的保守区域,MAb18B6可以结合并抑制B结构域中各个重复元件的二聚化作用,并抑制分属于两个细菌表面的Aap蛋白分子间的拉链状聚合,从而抑制细菌生物膜的形成；而MAb25C11和MAb20B9的抗原表位位于RP62A株Aap蛋白B结构域重复元件中的非保守区域,它们只能结合并抑制B结构域中部分重复元件的二聚化作用,因此它们对Aap蛋白分子间拉链状聚合的抑制作用明显低于MAb18B6,从而缺乏对细菌生物膜形成的抑制作用。随后,分别利用Dot-blot、WesternBlot及免疫荧光、荧光定量PCR分别测定表皮葡萄球菌中细胞外粘附因子Aap、eDNA及PIA的生物合成,3株单克隆抗体都可以促进浮游细菌和生物膜表面细菌Aap蛋白的表达,并可以促进生物膜中PIA的合成及eDNA的释放。这些改变都可以促进细菌间的相互粘附聚集,进而促使浮游的细菌聚集成团,并增强细菌生物膜的形成。因此,小鼠抗Aap单克隆抗体对表皮葡萄球菌细菌间粘附聚集和生物膜形成的影响存在两种相互矛盾的作用：其一,通过结合Aap蛋白B结构域重复元件中相应区域而抑制Aap蛋白二聚化并抑制细菌生物膜的形成；其二,通过影响细菌细胞外粘附因子的生物合成而促进细菌生物膜的形成。MAb25c11和MAb20B9本身缺乏对Aap蛋白二聚化的抑制能力,同时又上调了细菌细胞外粘附因子的生物合成,所以其对生物膜形成的作用最终表现为促进；MAb18B6虽然同样可以上调细菌细胞外粘附因子的生物合成,但是由于其具有较强的阻断Aap蛋白二聚化的能力,所以上调了的细胞外粘附因子的生物合成只是削弱了其对生物膜形成的抑制作用,MAb18B6最终显示出对生物膜形成的抑制。所以只有选择合适的Aap表位多肽作为疫苗,诱导产生具有较强抑制生物膜作用的抗体,才能达到预防生物膜形成的目的；反之,不适当的表位疫苗诱导产生的抗体反而可能会增强细菌生物膜的形