胆碱能抗炎通路在针刺预处理诱导脑缺血耐受效应中的作用机制研究

胆碱能抗炎通路在针刺预处理诱导脑缺血耐受效应中的作用机制研究目的:通过实验研究探讨针刺风池穴预处理对脑梗死大鼠的脑保护作用及机制,并以胆碱能抗炎通路为切入点,探讨其在针刺风池穴预处理诱导脑缺血耐受效应中的作用。方法:实验一:78只雄性成年SD大鼠,随机分为正常组6只,假手术组、脑梗死组、缺血预处理组和针刺预处理组各18只。每组又分为1天、3天、7天三个亚组,每组6只。采用改良ZeaLonga方法制备大脑中动脉闭塞脑梗死(MCAO)模型,针刺预处理组于造模前针刺大鼠双侧“风池”穴,连续7天。缺血预处理组于造模前24小时于颈外动脉插入自制线栓,栓塞大脑中动脉后,间断缺血30分钟。各组分别于处死前4小时进行神经功能评分,HE染色检测细胞形态,TUNEL法检测细胞凋亡,Real-timePCR和WesternBlot检测α7-nAChR、TLR4和NF-κB基因及蛋白的表达。所有数据用均数士标准差(X±S)表示,spss19.0版统计软件分析。实验二:36只健康成年SD雄性大鼠,随机分为正常组、假手术组、脑梗死组、针刺预处理组、针刺+迷切组和针刺+抑制剂组,每组6只。模型制备及针刺预处理方法同实验一。针刺+迷切组大鼠于针刺治疗开始前3天切断右侧迷走神经,之后进行针刺治疗7天,然后行脑梗死模型制备。针刺+抑制剂组大鼠于针刺开始时同步腹腔注射MLA,然后行脑梗死模型制备。各组分别于动物清醒12小时和处死前4小时进行神经功能评分,HE染色检测细胞形态,TUNEL法检测细胞凋亡,Real-timePCR和WesternBlot检测α7-nAChR、TLR4和NF-κB基因及蛋白的表达。免疫荧光双标染色分别检测a7-nAChR在星形胶质细胞和小胶质细胞上的表达。所有数据用均数土标准差(X±S)表示,spss19.0版统计软件分析。结果:实验一:神经功能评分结果显示缺血预处理和针刺预处理均可改善脑梗死后神经功能评分,且优于脑梗死组,p<0.05。HE染色结果显示,脑梗死组细胞形态学发生改变,3天时最重,而缺血预处理组和针刺预处理组各时间点细胞损伤程度均轻于脑梗死组。细胞凋亡结果显示脑梗死组、缺血预处理组和针刺预处理组TUNE1阳性细胞明显多于正常组和假手术组,p<0.01。各组于1天时阳性细胞数明显升高,3天达高峰,7天时开始下降,缺血预处理组和针刺预处理组各时间点TUNE1阳性细胞多于脑梗死组,p<0.01。Real-timePCR检测结果显示1天和3天时假手术组、脑梗死组、缺血预处理组和针刺预处理组a7-nAChRmRNA表达下调。缺血预处理组和针刺预处理组a7-nAChRmRNA表达高于脑梗死组,p<0.01。7天时各组间比较,差异无统计学意义,p>0.05。脑梗死后1天和3天时假手术组、脑梗死组、缺血预处理组和针刺预处理组TLR4mRNA和NF-κBmRNA表达上调。缺血预处理组和针刺预处理组TLR4mRNA和NF-κBmRNA表达低于脑梗死组,p<0.05。脑梗死7天时各组间TLR4mRNA和NF-κBmRNA表达无显著性差异,p>0.05。WesternBlot结果-显示:假手术组、脑梗死组、缺血预处理组和针刺预处理组a7-nAChR蛋A表达下降、TLR4和NF-KB蛋白表达升高,与正常组比较,差异均有统计学意义,p<0.01。缺血预处理组和针刺预处理组a7-nAChR蛋白表达高于脑梗死组,TLR4和NF-κB蛋白表达低于脑梗死组,p<0.01。实验二:神经功能评分结果显示:脑梗死组、针刺预处理组、针刺+迷切组和针刺+抑制剂组均有不同程度的神经功能缺损,针刺预处理组和针刺+迷切组神经功能评分优于脑梗死组,p<0.05。针刺+抑制剂组与脑梗死组比较,差异无统计学意义p>0.05。HE染色结果显示脑梗死组细胞形态损伤严重,针刺预处理组和针刺+迷切组可见少量神经细胞损伤改变,针刺+抑制剂组HE染色结果与脑梗死组相似。细胞凋亡结果显示:脑梗死组、针刺预处理组、针刺+迷切组和针刺+抑制剂组均存在较多的TUNE1阳性细胞,与正常组比较差异存在统计学意义,p<0.01。针刺预处理组和针刺+迷切组TUNE1阳性细胞少于脑梗死组,p<0.05。针刺+抑制剂组与脑梗死组比较,差异无统计学意义,p>0.05。Real-timePCR结果:针刺预处理组、针刺+迷切断组a7-nAChRmRNA表达均高于脑梗死组,NF-KBmRNA表达低于脑梗死组,p<0.05。针刺预处理组TLR4mRNA表达低于脑梗死组,p<0.01。针刺+迷切断组TLR4mRNA表达与脑攸梗死组相当,差异无统计学意义,p>0.05。针刺+抑制剂组a7-nAChRmRNA、TLR4mRNA和NF-KBmRNA表达水平与脑梗死组相当,差异无统计学意义,p>0.05。WesternBlot结果显示:针刺预处理组和针刺+迷切组a7-nAChR蛋白表达高于脑梗死组,TLR4和NF-κB蛋白表达低于脑梗死组,p<0.01。针刺+抑制剂组a7-nAChR、TLR4和NF-κB蛋白表达水平与脑梗死组相当,差异无统计学意义,p>0.05。免疫荧光双标检测结果显示:各组a7-nAChR在星形胶质细胞和小胶质细胞中均有表达,针刺预处理组和针刺+迷切组a7-nAChR/GFAP和a7-nAChR/CD11b阳性细胞数均多于脑梗死组,p<0.05,针刺+抑制剂组a7-nAChR/GFAP和a7-nAChR/CDllb阳性细胞数与脑梗死组相当,差异无统计学意义,p>0.05。结论:1、针刺风池穴预处理能够增强大鼠脑组织对缺血的耐受,使大鼠神经功能改善,神经细胞损伤减轻,抑制细胞凋亡,具有与缺血预处理类似的脑保护作用。2、针刺风池穴预处理可上调a7-nAChR基因和蛋白的表达,下调TLR4和NF-κB基因和蛋白的表达。3、切断单侧迷走神经不能完全阻断针刺预处理的脑保护作用及其对a7-nAChR、TLR4和NF-κB基因