发酵产物的提取与精制概论

第十章发酵产物的提取与精制概论第一节发酵产物的提取与精制概述一、发酵产物的分类1、菌体2、酶3、代谢产物二、下游加工过程的特点1、发酵液是复杂的多相系统，成分复杂：细胞、代谢产物、残余培养基2、产品浓度低：传统发酵一般1～10％3、普遍存在下游工程代价高，回收率较低（50％）左右等问题4、产品存在失活、不稳定性问题5、生物安全问题三、下游加工过程设计应遵循的基本原则1、时间短2、温度低3、pH适中4、清洁卫生四、发酵产物提取与精制的过程1、对未知的发酵产品提取的步骤（1）确定发酵产物的类型（2）确定发酵产物的稳定性2、发酵产物提取和精制过程的一般程序成品加工发酵液的预处理提取精制采用凝聚和絮凝技术加速固、液分离；如产物在细胞内，还要进行细胞破碎提取（初步纯化）目的是除去与目标产物性质差异大的杂质精制（高度纯化）是采用对产品有高度选择性的分离技术，除去与产物化学性质和物理性质相近的杂质最终获得质量合格的产品包括的阶段

（1）发酵液的预处理离心和过滤（2）产品的提取萃取、吸附、沉淀、蒸发（3）产品的精制层析、膜分离、离子交换、沉淀、电泳（4）产品的最后加工结晶、干燥、蒸馏第二节发酵醪的预处理

一、发酵醪的一般特征1、含水量高，一般可达90％～99%2、产品浓度低3、悬浮物颗粒小，密度与液体相差不大4、固体粒子可压缩性大5、液体黏度大，大多为非牛顿型流体6、产物性质不稳定二、发酵醪预处理的目的和要求1、预处理的目的：

改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中；能够除去部分杂质。2、发酵醪预处理的要求:（1）菌体的分离（2）固体悬浮物的去除（3）蛋白质的去除（4）重金属离子的去除（5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除（6）改变发酵醪的性质（7）调节适宜pH值和温度三、预处理的方法：1、加热法：降低悬浮液的黏度，除去某些杂蛋白，降低悬浮物的最终体积，破坏凝胶状结构、增加滤饼的空隙度不适用热敏性的物质2、调节悬浮液的pH

通过调节发酵醪pH到蛋白质的等电点使蛋白质沉淀，同时络合重金属离子；常用的酸化剂有草酸、盐酸、硫酸和磷酸3、凝聚和絮凝

凝聚：在投加的化学物质（比如水解的凝聚剂，像铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚成1mm大小块状凝聚体的过程。

凝聚剂的作用：有些是对初始粒子表面电荷的简单中和，另一些是消除双电荷层（采用中性盐例如NaCl等）而脱稳，还有些是通过氢键或其他复杂的形式与粒子相结合而产生凝聚。絮凝：使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。凝聚剂和絮凝剂的种类：（1）凝聚剂：主要是无机类电解质，大多为阳粒子无机盐类：硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁、三氯化铁、氯化铝、硫酸锌、硫酸镁、铝酸钠金属氧化物类：氢氧化铝、氢氧化铁、氢氧化钙、石灰聚合无机盐类：聚合铝、聚合铁（2）絮凝剂（按官能团分）阴离子、阳离子、非离子丙烯酰胺经不同的改性可成为上述三种类型之一絮凝剂比凝聚剂贵絮凝剂的最佳使用剂量：粒子表面积约有一半被聚合物覆盖时所用的絮凝剂量。4、添加助滤剂：

一般为惰性助滤剂：是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质

作用：助滤剂表面具有吸附胶体的能力，并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，可以保持良好的渗透性

使用方法（1）在滤布上预涂，作为过滤介质使用

（2）按一定比例混入待滤的悬浮液中常用的助滤剂：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的碳、炉渣、重质碳酸钙

助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，从而增加滤速；

常用硅藻土、珍珠岩等；

加入方法有两种：a)预先在滤布上铺上一层1-2mm厚的助滤剂；b)直接把助滤剂加入发酵液中。5、添加反应剂：添加可溶解的盐类，生成不溶解的沉淀；生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构；沉淀本身可作为助滤剂，还能使胶状物和悬浮物凝固。

6、添加酶制剂：

比如：加酶将多糖转化为单糖四、菌体的分离方法（1）离心分离管式高速离心机、碟片式离心机（2）过滤真空过滤机、板框过滤机、常用过滤设备1）板框(plateandframe)压滤机板框过滤机结构图

（曹军卫320页）1-尾板2-滤框3-滤板4-主梁5-头板6-紧压装置2）带式压滤机

发酵后期要少加消泡剂和少进行补料，防止消泡剂和未用完的培养基增加过滤难度；

菌体自溶前放罐可防止因菌体自溶释放出的代谢产物增加发酵液黏度3、影响发酵液过滤的因素1）菌体细胞体积

真菌菌丝体较粗大，质量比阻小，发酵液不需经特殊处理就很容易过滤；

放线菌菌丝细而分支，交织成网格状，质量比阻力大，较难过滤，发酵液需经预处理，凝固蛋白质等胶体物质，提高过滤速度；

细菌菌体更小，发酵液如不经絮凝等预处理，很难用常规过滤设备进行过滤操作。2）培养基组成黄豆饼粉、花生饼粉等会增加过滤难度3）放罐时机五、细胞破碎细胞破碎的意义微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在细胞内部。目前重组DNA技术，表达的产品（如胰岛素、干扰素、白细胞介素等），都是胞内产物。首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。常用破碎方法

机械法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、X-press法等非机械法：酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等1、机械破碎法特点：处理量大、破碎效率高、速度快；原理：对物料的挤压和剪切作用；主要方法：

高压匀浆珠磨超声波破碎高压匀浆（1）原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的间隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击后，急速释放到低压环境，在撞击力与剪切力的综合作用下破碎。（2）影响破碎率的因素：细胞壁、压力、温度、通过匀浆器的次数

不适合丝状真菌及包含体的基因工程菌

珠磨

工作原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂，即微球（玻璃小珠、石英砂、氧化铝d<1mm）一起快速搅拌，细胞与微球之间互相碰撞、剪切，使细胞破碎，释放内含物。

珠磨

特点：微球粒径与目标细胞的直径比应在30-100之间，适宜的微球粒径，可以使破碎效率最高；破碎过程产生热能，要注意热交换；适用于绝大多数微生物细胞的破碎；珠磨法的破碎率一般控制在80%。超声波破碎1、工作原理在超声波的作用下，液体发生空化作用，空穴的形成，增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎2、影响因素：声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型超声波破碎

3、特点：1）适应于实验室规模的应用（操作简单、液量损失少，可加冰或加冷水，大规模操作时，声能传递和散热困难）2）易失活物质不宜用（超声波可促使产生一些化学自由基因使物失活）3）G-杆菌破碎效果好，酵母菌效果差2、非机械法（1）酶溶法：（2）化学法利用化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法①酸碱来调节溶液的pH②有机溶剂：甲苯③表面