多觉型C纤维传导丢峰的活动规律与机制及其外周镇痛作用

多觉型C纤维传导丢峰的活动规律与机制及其外周镇痛作用外周无髓鞘纤维C类传入纤维是由背根节小细胞发出的外周突，其主要功能是将外周的伤害性信息传入脊髓。长期以来，人们认为轴突只是一根相对简单的“导线”，其任务是忠实地传导携带神经信息的动作电位序列。然而越来越多的研究发现：无髓鞘纤维的传导功能具有传导速度活动依赖性减慢和传导丢峰现象，使得动作电位序列的传入模式和数量都发生改变。结果提示C纤维并非忠实地传递神经信息，可能在传导过程中对放电序列进行信息加工和整合。我室前期工作发现家兔隐神经C纤维具有传导丢峰现象，传导丢峰现象是指动作电位序列在轴突上传递过程中发生丢失的现象，并将丢峰模式分为三类：不丢峰、规则丢峰和不规则丢峰。我们进一步发现糖尿病神经病理痛模型尾神经中多觉型伤害性Ｃ纤维的传导丢峰程度显著下降，并伴随着初始传导速度加快以及传导速度活动依赖性减慢程度降低等现象，提示传导丢峰程度的减弱参与了糖尿病神经痛敏的形成。但是多觉型伤害性Ｃ纤维传导丢峰程度的变化在慢性炎症痛敏形成过程起到什么作用？哪些关键离子通道电流和分子参与了传导丢峰的调变机制？通过何种途径可能增加传导丢峰程度，进而实现镇痛效应？这将是我们接下来研究课题的主要内容。本研究以CFA慢性炎性痛模型尾神经中多觉型伤害性Ｃ纤维为对象，运用在体单纤维记录的方法研究C纤维传导丢峰的规律和特征。以Ｃ纤维的胞体—DRG小细胞为标本，采用整节DRG膜片钳记录的方法研究传导丢峰发生的离子通道机制。采用免疫组织化学染色的方法观察DRG小细胞和C纤维上相关通道表达的变化。最后通过在坐骨神经周围注射Ih电流的特异阻断剂ZD7288研究增加传导丢峰对动物痛敏行为的影响。第一部分：传导丢峰的特征及规律实验以尾部皮下注射CFA3-5天的大鼠尾神经中多觉型伤害性C纤维为研究对象，在感受野皮下给予不同频率的电刺激，在记录电极和刺激电极之间的神经干施加药物，采用在体单纤维记录的方法研究传导丢峰的规律和特征，结果表明：1.通过感受野对机械伤害性刺激和热伤害性刺激均起反应的Ｃ纤维定为多觉型伤害性C纤维，仅对机械刺激发生反应的C纤维定为机械敏感C纤维。结果发现在10Hz电刺激频率下多觉型伤害性C纤维传导丢峰程度显著大于机械敏感C纤维（多觉型伤害性C纤维组：45.8%±4.7%，机械敏感C纤维组：5.8%±2.4%，P<0.05）。重复刺激多觉型伤害性C纤维时，传导速度减慢程度（Slowingofconductionvelocity,CVs）显著大于机械敏感C纤维组（多觉型伤害性C纤维：35.5%±1.5%，机械敏感C纤维：9.1%±0.7%，P<0.05）。但两者初始传导速度（Initialconductionvelocity,CVi）并无显著差异（多觉型C纤维组：0.75±0.04m/s，机械敏感C纤维组：0.82±0.07m/s，P>0.05）。2.在后续的实验中以多觉型伤害性C纤维为研究对象。在感受野给予2Hz,5Hz和10Hz的电刺激，与正常对照组相比，CFA组多觉型伤害性Ｃ纤维的丢峰程度均显著降低，随着刺激频率的增高传导丢峰程度相应增大。CFA组丢峰程度分别为0.73%±0.31%，8.03%±1.83%和16.58%±3.46%，正常对照组的传导丢峰程度分别为5.36%±2.51%，30.99%±4.08%和50.55%±4.39%，在5Hz和10Hz电刺激频率下CFA组传导丢峰程度显著低于正常对照组（P<0.05）。在2Hz电刺激频率下测量初始传导速度，CFA慢性炎性痛后初始传导速度显著增加（CFA组：0.79±0.02m/s，对照组：0.69±0.02m/s，P<0.05），但传导速度减慢程度却显著降低（CFA组：19.51%±1.1%，对照组：24.96%±0.7%，P<0.05）。3.在记录电极和刺激电极之间的神经干上分别施加不同浓度的Ih电流的特异阻断剂ZD7288（5,10,20,40μM），在10Hz电刺激频率下ZD7288浓度依赖性地增加传导丢峰程度（依次为30.63%±2.56%，32.51%±1.82%，39.35%±3.25%，50.93%±3.64%），施加ZD7288前传导丢峰程度为15.44%±2.61%（P<0.05）。在2Hz电刺激频率下观察ZD7288（40μM）对传导速度特性的影响，发现加药后CVs显著增大（加药前：19.11%±1.41%，加药后：22.51%±2.42%，P<0.05），但对CVi却没有显著影响（加药前：0.78±0.02m/s，加药后：0.75±0.02m/s，P>0.05）。4.ZD7288活动依赖性增加传导丢峰程度。CFA组多觉型C纤维在2Hz电刺激频率下均不丢峰，施加ZD7288（40μM）后丢峰程度为2.08%±2.08%，两者没有显著的统计学差异。在5Hz的电刺激下，丢峰程度由原来的3.73%±2.14%增加到15.67%±4.21%，具有统计学差异（P<0.05）。在10Hz电刺激频率下，丢峰程度由15.44%±2.6%增加到50.93%±3.64%，具有显著统计学差异（P<0.05）。5.在同样的电刺激频率（10Hz）下，ZD7288（150μM）选择性增加多觉型伤害性C纤维的传导丢峰程度并降低初始传导速度，但是对有髓鞘A类纤维的传导速度无显著影响，也未出现传导丢峰现象，表明ZD7288选择性增加多觉型伤害性C纤维的传导丢峰程度而不影响有髓鞘Ａ类纤维传导。6.CFA后，大约20%的C纤维出现自发放电，放电频率在0.5Hz-3Hz之间。在神经干施加不同浓度的ZD7288（40μM，150μM，500μM），可浓度依赖性抑制自发放电频率，（加药后分别为：0.90±0.11Hz，0.59±0.05Hz，0.45±0.03Hz，加药前：1.32±0.18Hz，P<0.05），且加药后自发放电的脉冲间距（Interspikeinterval，ISI）相应增加。7.在记录电极和刺激电极之间的神经干上施加低阈值钾电流的特异阻断剂α-DTX（0.5nM），可显著降低传导丢峰程度(加药前：35.45%±4.23%，加药后：8.42%±1.43%，P<0.05)。施加α-DTX后初始传导速度显著增加(加药前：0.69±0.02m/s，加药后：0.78±0.01m/s，P<0.05)，但CVs显著减小(加药前：23.5%±0.71%，加药后：17.1%±0.79%，P<0.05)。第二部分：传导丢峰离子通道机制由于C纤维的直径较小，难以直接对其离子通道机制进行研究。而C纤维是由DRG小细胞发出的外轴突，轴突上通道蛋白在胞体合成后运输到轴突特定部位，所以本部分实验通过膜片钳记录慢性炎性痛DRG小细胞上离子通道电流和兴奋性的变化来反映轴突兴奋性和离子通道的变化。1.CFA后DRG小细胞基强度下降、阈值偏向超极化和动作电位上升斜率增大，表明DRG小细胞兴奋性显著升高，但静息膜电位并未发生显著变化。2.在记录浴槽中施加低阈值钾通道阻断剂α-DTX（100nM），可增加不同强度的去极化刺激诱发的DRG小细胞的放电数目，动作电位的阈值偏向更超极化水平，基强度减小，但是对动作电位的幅度、波宽和上升斜率没有显著影响。3.CFA组DRG小细胞α-DTX敏感钾电流显著减小(P<0.05)，但是其激活特性未发生显著的变化。4.先将细胞钳制在-60mV，然后在-60mV到-130mV之间再分别施加持续6s的不同超极化水平的钳制，发现CFA后DRG小细胞Ih电流从-110mV起显著增大(P<0.05)。5.CFA组DRG小细胞放电的后超极化电位（AHP）的幅度和时程均显著减小(P<0.05)，当在浴槽中施加ZD7288（40μM）时可显著增大CFA组AHP幅度（正常组AHP幅度：12.2±0.62mV,n=15；CFA组AHP幅度：8.1±0.74mV，n=12；CFA+ZD7288组：10.5±0.53mV，n=12，P<0.05）和时程（对照组AHP半宽：30.2±2.5ms，n=15；CFA组AHP半宽：15.8±2.7ms，n=12；CFA+ZD7288组：25.6±3.3ms，n=12，P<0.05)。第三部分：慢性炎症DRG小细胞和C纤维上HCN1和HCN2通道表达增加本部分采用免疫组织化学的方法观察CFA组DRG小细胞和C纤维上HCN1和HCN2通道表达的变化。1.CFA组DRG小细胞和C纤维上HCN1通道表达均上调,DRG小细胞上HCN1的荧光强度增加（CFA组：49.5±4.3，对照组：23.4±3.8，P<0.05），C纤维HCN1通道荧光强度增加（CFA组：45.8±5.4，对照组17.6±3.5，P<0.05）。2.CFADRG小细胞和C纤维上HCN2通道表达均上调，DRG小细胞上HCN2的荧光强度增加（CFA组：64.5±8.6，对照组：26.5±6.8，P<0.05），C纤维HCN2通道荧光强度增加（CFA组：44.6±7.6，对照组20.3±4.2，P<0.05）。第四部分：坐骨神经周围局部注射Ih电流的特异阻断剂ZD7288抑制机械痛敏和热痛敏本部分实验采用在坐骨结节和大转子之间的坐骨神经周围注射不同浓度ZD7288（15μM,50μM,150μM,500μM）的方法观察增加传导丢峰程度对动物痛敏行为反应的影响，还同时观察这种给药方法对运动功能和心率变化的影响。1.坐骨神经周围注射ZD7288可浓度和时间依赖性地部分抑制机械痛敏和热痛敏，ZD7288可浓度依赖性地抑制福尔马林炎性痛动物的自发痛行为。2.坐骨神经周围注射ZD7288不影响动物的运动功能。3.坐骨神经周围注射ZD7288（500μM，0.2ml）不影响动物心率，但腹腔注射（4mg/kg）可显著降低动物心率。主要结论：1.在CFA慢性炎性痛模型,发现多觉型伤害性C纤维的传导丢峰程度显著降低。2.首次发现ZD7288可浓度依赖性和活动依赖性地增加多觉型伤害性C纤维的传导丢峰程度,但不影响有髓鞘A类神