布比卡因致神经元DNA损伤及相关修复通路激活的研究

布比卡因致神经元DNA损伤及相关修复通路激活的研究神经阻滞是一种局部镇痛完全、操作简便、对患者生命体征干扰小的麻醉方式,其不良反应和并发症远低于全身麻醉,因而广泛应用于临床麻醉及术后镇痛治疗等多个领域。神经阻滞主要应用局部麻醉药(LocalAnesthetics,LA)通过阻断神经冲动传导以达到阻滞效果,但其可引起神经毒性反应,尤其局麻药高浓度或长时间作用于周围神经时,可引起神经毒性损伤导致神经功能障碍,因而引起临床工作者与研究学者们的高度重视。流行病学调查资料表明：30%脊麻后的病人可发生短暂神经病学综合征,而严重的神经损伤并发症如马尾综合征发生率可达1/8238-1/2834。国内外学者虽对局麻药引发神经毒性进行了大量研究,但其确切机制至今仍未阐明。局麻药的种类、剂量、时间等可影响局麻药的神经毒性,作用机制可能与局麻药影响细胞膜钙离子通道、细胞内钙离子浓度及诱导细胞凋亡与炎性反应等相关。我们前期的研究结果表明：局麻药可使人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞ATP生成减少,激活AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)信号通路,引起ROS爆发性增多,最终导致神经细胞凋亡；局麻药尚可通过激活细胞膜表面的T型钙离子通道,触发细胞内钙超载促进细胞凋亡,引起神经细胞毒性损伤。此外,我们在研究中发现局麻药可致神经肿瘤SH-SY5Y细胞DNA损伤从而导致细胞的凋亡及坏死。DNA作为生物体最重要的遗传物质,其稳定性决定生物的生存和发展。但生物体本身基因的完整性容易受外在环境因素影响,辐射线的伤害或化学试剂的破坏均可造成DNA的双键结构断裂造成损伤。氧化应激是由内、外源因素引起的细胞氧化性物质的产生超过细胞内抗氧化体系的负荷,打破了的细胞内微环境氧化/还原动态平衡的状态。有证据表明,氧化应激/ROS是导致细胞DNA损伤的重要因素之一。我们前期研究也已证实细胞内ROS爆发是局麻药引起神经细胞毒性的重要机制。因此,局麻药也可能通过细胞内ROS爆发造成神经细胞的DNA损伤,由此引起神经功能并发症!由于危险因素的种类和作用机制不同,DNA损伤的类型也是多种多样,损伤后的DNA会启动相关的损伤修复信号通路。氧化应激/ROS导致的细胞DNA的损伤主要是以氧化型碱基损伤居多,应对针该这类氧化损伤主要是通过切除修复机制完成修复,如：DNA碱基切除修复(BER)和核酸切除修复(NER)。我们前期研究显示：局麻药可使人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的DNA损伤(碱性条件下彗星实验分析DNA损伤情况),损伤后的SH-SY5Y细胞核酸切除修复通路中的XPD(xerodermapigmentosumcomplementationgroupD,着色性干皮病基因D)修复酶表达水平增加。而局麻药造成的神经细胞DNA损伤的类型可能有多种,损伤后修复亦有多种不同的修复通路参与；目前可能参与的修复通路有碱基切除修复(BER)、核酸切除修复(NER)、错配修复(mismatch)、重组修复(recombination)。局麻药导致的神经细胞DNA损伤后与上述修复通路关系如何及其修复能力的强弱?国内外未见报道。藉此,我们行cDNA微孔板基因筛查和iTRAQ蛋白组学筛查,结果显示：局麻布比卡因药处理神经细胞后,核酸切除修复酶XPD、碱基切除修复酶PARP1表达显著性增高。由此推测,以上2条通路可能是局麻药致神经细胞DNA损伤后的重要修复途径。明确上述假设,阐明该损伤后修复机制可为更精准、有效防治局麻药致神经毒性损伤提供新的思路和靶点。为论证以上假说,该研究拟采用离体细胞实验及在体动物研究两部分,采用多种分子生物学技术,分别从以下四章进行论述：第一章研究布比卡因致神经细胞毒性反应和DNA损伤情况目的建立细胞和大鼠的布比卡因导致神经毒性损伤和DNA损伤模型,探讨布比卡因致神经细胞毒性反应和DNA损伤情况方法1.细胞模型首先采用不同浓度的布比卡因处理SH-SY5Y细胞,CCK-8检测细胞活力计算布比卡因的IC50值,LDH检测各组的细胞毒性情况,选取该IC50值作为后续细胞模型的浓度；应用布比卡因的IC50值浓度处理SH-SY5Y细胞3小时后,换成正常培养基再孵育24小时作为损伤模型组,分别用Hochest-33258、TUNEL剂盒检测细胞凋亡,JC-1检测细胞线粒体膜电位变化,DHE检测细胞内氧化应激水平,彗星实验测定细胞的DNA损伤情况。Westernbolt测定凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值、cleave-caspase3表达,DNA损伤标志蛋白p-γH2ax表达。2.动物模型我们选用SD大鼠鞘内置管后,注射3%布比卡因作为动物损伤模型;脊髓组织HE染色观察神经元病理改变；ELISA检测氧化损伤产物丙二醛(MDA)与氧化DNA损伤指标8羟基脱氧鸟苷(8-oxodG);TUNEL法和凋亡相关蛋白Bcl-1/Bax比值检测脊髓组织神经元凋亡情况；Westernblot检测各组大鼠脊髓组织DNA损伤指标-yH2ax蛋白的磷酸化水平；通过大鼠足底光热刺激潜伏期(PWTL)、机械痛缩足阈值(PWMT)检测来说明动物对热痛、机械痛刺激的敏感程度；从行为学上判断大鼠的脊髓神经功能受损伤情况。统计学方法实验中计量资料以x±s来表示,我们采用SPSS13.0统计学软件分析,多重比较或两两比较采用LSD法(方差齐情况选用)或Dunnett’sT3法(方差不齐情况选用),组间比较则采用两独立样本的t检验,P<0.05代表差异有统计学意义。结果1.细胞模型CCK-8法检测布比卡因不同浓度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mM)各组细胞活力结果显示：不同浓度布比卡因处理细胞后,布比卡因的IC50值(半抑制浓度)=1.5mM;LDH试剂盒检测细胞培养上清液中LDH的含量结果显示：与对照组比较,从Bup1.5mM浓度组开始细胞毒性明显增高(*p<0.05),布比卡因的细胞毒性呈浓度依赖性；Hochest-33258、TUNEL检测各组细胞凋亡情况,结果显示：1.5mM布比卡因处理细胞后可导致SH-SY5Y细胞凋亡比例增加(*p<0.05),凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值降低,凋亡蛋白cleave-caspase3表达增多(*p<0.05)；。JC-1检测各组细胞线粒体膜电位的变化,结果显示：布比卡因处理SH-SY5Y细胞后可明显降低细胞线粒体膜电位(*p<0.05),导致线粒体的损伤；布比卡因处理SH-SY5Y细胞后DHE阳性显著性增高(*p<0.05),表示细胞内ROS增加；彗星实验(cometassay)相关指标(彗星尾距)增高(*p<0.05),yH2ax蛋白的磷酸化水平增多(*p<0.05)表示布比卡因处理SH-SY5Y细胞后细胞DNA损伤明显加重。2.动物模型脊髓组织HE结果显示对照组大鼠脊髓神经元细胞形态、结构正常。6h组、12h组与24h组有部分神经细胞核固缩、碎裂、溶解、变性、坏死或消失。24h组神经细胞变性、坏死数量显著多于其他各组；各组脊髓组织的氧化损伤产物MDA结果显示：与对照组比较,模型组MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)；TUNEL检测结果显示：与对照组比较,模型组大鼠脊髓神经元凋亡比例明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)；脊髓组织凋亡相关蛋白Bcl-2/bax的表达量比值明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);ELISA试剂盒检测各组大鼠脊髓组织均浆上清中8-oxo-dG的含量结果显示：与对照组比较,模型组8-oxo-dG含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较,模型组脊髓组织yH2ax蛋白的磷酸化水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；行为学结果显示：与对照组比较,模型组大鼠机械痛缩足阈值(PWMT)和大鼠足底光热刺激潜伏期(PWTL)值均增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本章实验证实：布比卡因可导致神经细胞毒性损伤,表现为细胞凋亡比例增高,凋亡相关蛋白表达增高,细胞内氧化应激水平增高,线粒体膜电位改变,DNA损伤加重。第二章基因和蛋白组学筛查探讨局麻药导致神经元DNA损伤后其相关修复通路中关键修复酶的变化目的通过基因和蛋白组学筛查探讨局麻药导致神经元DNA损伤后其相关修复通路中关键修复酶的变化方法首先建立布比卡因导致的神经细胞SH-SY5Y毒性损伤模型,应用cDNA微孔板阵列技术做关于DNA损伤修复通路中的一些重要的调控因子和修复酶的基因筛查；应用iTRAQ蛋白组学技术筛查局麻药神经损伤模型组(B组)与对照组(C组)之间差异蛋白,‘尤其是DNA损伤修复相关通路的蛋白表达差异情况。统计学方法实验中计量资料以x±s来表示,我们采用SPSS13.0统计学软件分析,多重比较或两两比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’sT3法(方差不齐),组间比较则采用两独立样本的t检验,P<0.05代表差异有统计学意义。结果cDNA微孔板实验结果显示：与对照组细胞比较,布比卡因处理后差异表达基因统计如下：DNA-PKcs、PTE、NTH1、RAD9、CSB、GADD45、XPD、XPC-HR23B、P53;分析得出,这些修复基因主要集中在以下3修复机制：1.碱基切除修复(Baseexcisionrepair);2.核酸切除修复(Nucleotideexcisionrepair);3.非同源重组修复(Non-homologousend-joining)。iTRAQ蛋白组学筛查结果显示：与对照组细胞比较,布比卡因导致的神经细胞DNA损伤后被激活的损伤修复酶大多集中在碱基切除修复通路(po1δ、ploβ、PARP)和核酸切除修复通路(]HR23B、RFC、polδ、XPD)上。结论通过cDNA微孔板和iTRAQ蛋白组学筛查,我们发现局麻药导致的神经细胞DNA损伤后差异表达的修复蛋白主要集中在以下2条修复机制：1.碱基切除修复(Baseexcisionrepair);2.核酸切除修复(Nucleotideexcisionrepair)。第三章局麻药导致神经细胞DNA损伤修复通路及关键差异修复酶的表达验证目的基于上一章基因和蛋白组学筛查的结果,验证筛查得到的局麻药导致神经细胞DNA损伤修复通路及关键差异修复酶)KPD、PARP-1的表达。方法1.细胞模型应用1.5mM布比卡因处理SH—SY5Y细胞后观察3h,6h,12h,24h不同时间点关键DNA损伤修复基因(XPD、PARP-1)的mRNA和蛋白表达情况；Q-PCR验证布比卡因导致的SH-SY5Y细胞DNA损伤模型中关键修复基因XPD、PARP-1的mRNA的表达情况;Westernblotting检测布比卡因导致的SH-SY5Y细胞DNA损伤模型中关键修复酶XPD、PARP-1的蛋白表达情况；2.动物模型采用第一章节建立的大鼠鞘内注射3%布比卡因24小时后取材为动物损伤模型,Westernblotting检测大鼠脊髓组织XPD修复酶的蛋白表达Westernblotting和免疫组化(IHC)检测大鼠脊髓神经DNA损伤模型中“关键修复酶”KPD、PARP-1的表达情况；统计学方法实验中计量资料以x±s来表示,我们采用SPSS13.0统计学软件分析,多重比较或两两比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’sT3法(方差不齐),组间比较则采用两独立样本的t检验,P<0.05代表差异有统计学意义。结果1.细胞模型qPCR检测细胞XPD修复酶mRNA的表达,结果显示：与对照组细胞比较,布比卡因处理后不同时间点XPD酶的mRNA表达均上升,统计学意义(P<0.05)；qPCR检测细胞PARP-1修复酶mRNA的表达,结果显示：与对照组细胞比较,布比卡因处理后不同时间点PARP-1酶的mRNA表达均上升,统计学意义(P<0.05)；Westernblotting检测细胞XPD修复酶的蛋白表达,结果显示：与对照组细胞比较,布比卡因处理后不同时间点XPD酶的蛋白表达均上升,但是3h时升高没有统计学差异(P>0.05),其他时间点XPD蛋白表达升高均有统计学差异(*P<0.05)；Westernblotting检测细胞PARP-1修复酶的蛋白表达,结果显示：与对照组细胞比较,布比卡因处理后3hPARP-1蛋白表达无统计学差异(P>0.05),其他时间点PARP-1的蛋白表达均上升,有统计学差异(*P<0.05)。2.动物模型Westernblotting检测大鼠脊髓组织XPD修复酶的蛋白表达,结果显示：与对照组相比,损伤模型组大鼠脊髓组织中XPD蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(*P<0.05)；检测大鼠脊髓组织PARP-1修复酶的蛋白表达,结果显示：与对照组相比,损伤模型组大鼠脊髓组织中PARP-1蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(*P<0.05);IHC检测大鼠脊髓组织切片XPD修复酶的蛋白表达情况,结果显示：与对照组相比,损伤模型组大鼠脊髓组织中XPD蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(*P<0.05)；检测大鼠脊髓组织切片PARP-1修复酶的蛋白表达,结果显示：与对照组相比,损伤模型组大鼠脊髓组织中PARP-1蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(*P<0.05)结论布比卡因导致神经元DNA损伤后会激活核酸切除修复通路(关键酶XPD)和碱基切除修复通路(关键酶PARP-1),该部分结果与cDNA微孔板和iTRAQ蛋白组学关于DNA损伤修复通路的筛查结果一致。第四章局麻药导致的神经细胞DNA损伤修复通路及关键差异修复酶的功能作用验证目的验证局麻药导致的神经细胞DNA损伤模型中筛查出的修复通路及关键差异修复酶的功能作用方法通过XPD低表达慢病毒感染SH-SY5Y细胞并建立低表达XPD的SH-SY5Y细胞株;在GV211-RNAi慢病毒感染SH-SY5Y细胞低表达XPD酶后,采用彗星实验和Westernblotting检测的DNA损伤标志性蛋白γ-H2ax磷酸化水平来评价该模型中细胞DNA损伤修复情况,LDH检测该模型中细胞毒性情况,AnnexinV-FITC/PI流式细胞术检测各组细胞凋亡比例,Westernblotting检测凋亡相关蛋白的表达；在建立布比卡因导致的神经细胞毒性损伤的模型前,我们使用PARP-1抑制剂20nM-PJ34预处理SH-SY5Y细胞,采用彗星实验和Westernblotting检测的DNA损伤标志性蛋白y-H2ax磷酸化水平来评价该模型中细胞DNA损伤修复情况；LDH检测该模型中细胞毒性情况,AnnexinV-FITC/PI流式细胞术检测各组细胞凋亡比例,Western