丙泊酚对发育小鼠海马齿状回神经干细胞的调控及其机制研究

丙泊酚对发育小鼠海马齿状回神经干细胞的调控及其机制研究研究背景:每年都有数以百万计的婴幼儿在全身麻醉下安全实施外科手术或有创检查。然而,越来越多可信的啮齿类和灵长类的动物研究表明暴露于临床常用的麻醉药可对发育中的大脑产生神经毒性,进而导致远期的神经认知功能障碍产生。临床流行病学研究证实<4岁儿童多次实施丙泊酚麻醉后认知功能障碍的发生率出现明显增加。这些研究结果对目前安全使用于产科和儿科的全身麻醉药丙泊酚提出严重质疑。全身麻醉药根据使用方式可分为吸入麻醉药及静脉麻醉药,其主要通过改变NMDA和(或)GABA受体影响突触传递进而产生麻醉效应。既往在体动物实验数据提示抑制NMDA受体、激活GABA受体可对发育期大脑产生毒副作用。丙泊酚作为激活GABA受体起效的最典型的静脉全麻药物,因其毒副作用小、麻醉诱导起效快、代谢快且体内无蓄积等优点,因而在临床产科和儿科麻醉中广泛使用。目前临床上关于使用丙泊酚麻醉导致产生远期学习记忆功能障碍的存在争议,在体研究证实丙泊酚对发育中大脑的神经元有促凋亡作用,反复多次应用丙泊酚可导致神经细胞凋亡数量增多,进而引起成年后学习记忆能力受损。但目前临床和基础研究显示丙泊酚影响学习、记忆力的机制仍未明确,尤其是针对发育期大脑的功能形成及对远期学习、记忆力影响的研究尚未深入开展。海马是参与认知、学习和记忆等脑高级功能的重要脑区,也是在生后哺乳动物包括人类都能观察到存在神经干细胞持续产生即神经发生的主要脑区之一。研究表明海马齿回颗粒下区神经干细胞的神经发生对脑功能发育和远期行为关系密切。发育期海马内神经干细胞可通过自我增殖来维持不断的神经发生,同时干细胞的突起可以起到支架作用引导神经元的迁移与成熟。调控发育期海马齿状回神经干细胞的因素将是调控其远期功能形成的关键靶点。研究表明麻醉药神经毒性引起的认知功能障碍与药物暴露的时期密切相关,麻醉药物所致的神经元凋亡通常出现在出生后2周,在出生后7天时达高峰。既往研究发现丙泊酚单次剂量注射与重复剂量注射均可导致发育期大脑神经元凋亡及退化;最新的研究表明丙泊酚可以通过损害成年海马新生神经元的存活与成熟调节海马的神经发生;此外丙泊酚可显著减少月龄三个月大鼠海马齿状回神经元的分化,增加星形胶质细胞的数量;然而体外实验证实丙泊酚临床相关剂量可增加神经干细胞向不同类型神经元的转化。由此看来,不同剂量的丙泊酚或者不同时期应用丙泊酚对神经系统的影响存在不同的效应。因此,对于处在脑发育高峰期(出生后7天,即p7)的小鼠,丙泊酚对其海马功能形成的影响仍有待考究;全麻药丙泊酚是否通过调控海马齿状回干细胞进而影响机体认知功能目前尚不清楚。阐明丙泊酚对发育机体海马的神经干细胞的影响及机制,将为临床婴幼儿期丙泊酚麻醉后出现认知功能障碍提供新机制,同时为临床产科及儿科麻醉中合理用药及相关疾病的诊断和治疗提供新的思路。研究方法:研究运用7日龄小鼠(p7),单次腹腔注射丙泊酚30mg/kg(prop(30mg/kg))、60mg/kg(prop(60mg/kg))或者同体积的脂肪乳剂(vehicle)建立模型。通过免疫组化检测干细胞增殖特异性抗体标记物brdu、sox2及干细胞特异性抗体nestin、blbp在海马齿状回的表达,并进行比较分析,明确发育期丙泊酚暴露对海马齿状回中干细胞的影响。同时通过研究分析星形胶质细胞标记物gfap、小胶质细胞iba-1的改变评估早期丙泊酚暴露对海马齿状回中神经胶质细胞的影响。此外,通过westernblot检测海马中sox2蛋白的表达差异验证发育期丙泊酚暴露对海马齿状回中干细胞增殖能力的影响,并通过检测akt,pakt,erk1/2,perk1/2海马中蛋白表达差异探讨丙泊酚暴露对早期海马齿状回干细胞的作用分子机制。研究结果:1.采用细胞增殖相关的特异性抗原标记物brdu与sox2检测丙泊酚对p7小鼠海马齿状回中干细胞增殖的影响。免疫组化结果显示相对于vehicle组,prop(30mg/kg)组海马齿状回中brdu(+)、sox2(+)数量减少无统计学意义,而prop(60mg/kg)组中brdu(+)、sox2(+)数量出现显著性减少;不同剂量药物组间比较存在统计学差异,prop(60mg/kg)组中brdu(+)、sox2(+)下降更明显。2.通过检测早期神经干细胞特异性抗体标记物(nestin、blbp)比较丙泊酚处理发育小鼠后海马齿状回内干细胞的特征变化,免疫荧光发现prop(60mg/kg)组海马内神经干细胞的数量下降且部分长突起受损,预示高剂量丙泊酚可损伤发育小鼠海马神经干细胞形态。3.免疫荧光结果表明Prop(60mg/kg)组海马齿状回中标记星形胶质细胞的GFAP数量较Vehicle组明显减少,Prop(30mg/kg)组中GFAP数量无明显改变;小胶质细胞的特异性抗体Iba-1的免疫荧光结果显示Prop(60mg/kg)与Prop(30mg/kg)组均显著性降低海马齿状回中小胶质细胞的数量。4.Westernblot结果表明:丙泊酚药物处理组海马中Sox2蛋白表达降低,统计学分析发现Vehicle组与Prop(60mg/kg)组及Prop(30mg/kg)组之间Sox2蛋白表达均存在显著性差异。5.Westernblot结果表明:丙泊酚处理组海马中Akt及Erk表达水平无明显改变,而pAkt及pErk表达水平下调,Prop(60mg/kg)组中下调更为显著。统计学分析表明,Prop(30mg/kg)与Prop(60mg/kg)组较Vehicle组相比海马中pAkt水平分别下降26%和49%,pErk表达水平分别下调43%和61%。研究结论:1.