shRNA详细原理及引物设计工程科技

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shRNA原理

shRNA克隆原理及引物设计

一．DNAoligo设计

1.来源：1）文献报道（优先考虑）

2）网站

利用网站供应的软件设计DNAoligo：

主要使用网站有3个,老师认为不同算法得到重合的序列比较牢靠,故三者应综合使用网站:

举例：HEXIM1shRNA设计

A:siDirect

输入accessionnumber,点”retrievesequence”,得到完整序列.或直接输入序列

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设置只要将contiguoussequencestoavoid-A'sorT's选上,如图下

点designsiRNA

结果:页面一次只显示100个碱基(如1-100),需要点击所需段来查看

优先选择“Effective,Bothstrand”,但“Effective,Plusstrand”也可用显示的序列23个碱基,应去头尾各2个,取中间19位碱基

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B:Dharmacon

输入accessionnumber,step4中选blast,database选human点”designsiRNAs”

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结果:优先选择score高,mismatch为3或大于3,且不要化学修饰的序列

C:Ambion

序列可由SiDirect或其他位置粘贴过来,

设置中选中”4.Sequenceconstraintstoavoid:4ormoreA'sorT'sinarow”,点submit

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结果:本网站生成的序列全部以AA开头,后19位为所要序列

最终结果

完全重合很难实现,所以也接受小部分不重合.举例:得到以下结果,

1.TTCAACAGCTGGGCAAGTTTAAG

1619

AACAGCTGGGCAAGTTTAAGG1622

MatchedbySiDirect,Dharmacon(1619)andAmbion(1622)

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然后任凭选择一段,CAACAGCTGGGCAAGTTTA(起点1621)或CAGCTGGGCAAGTTTAAGG(1624)均可标注为”sh+基因+起点”如:shPRKD1-2616

注：由于所设计的每个oligo并不都具有knockdown效果，针对每个protein

设计oligo时，一般设计4-5个不同的oligo序列以便筛选。

2．shRNA设计model

shRNAdesignModel

A.NewpSUPER-BXandpSR-H1shRNAdesignmodel:BamHI-XhoIsite

shF:5’

3’

shR:5’

3’

Example:

shCdk2-85F:GGTGGTGGCGCTTAAGAAAR:TTTCTTAAGCGCCACCACC

shCdk2-85

shCdk2-85

B.OldpSUPERshRNAdesignmodel:BglII-HindIIIsite

sh

sh

Example:

shCdk2-85F:GGTGGTGGCGCTTAAGAAAR:TTTCTTAAGCGCCACCACC

shCdk2-85

shCdk2-85

二．合成后DNAoligo的溶解

1）DNAoligo溶解前，13000rpm离心3min。（由于合成的DNAoligo为粉末状态，且管内处于真空状态）

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2）用经高压灭菌后的ddH2O将DNAoligo定量至3μg/μl。ddH2O的体积(V/μl)=DNAoligo的质量（mg）1000／3注：所取ddH2O的体积尽量精确     。

3）常温放置30min，使DNAoligo充分溶解。

三．DNAoligo的退火1）退火体系（50μl）正向DNAoligo（F）:1μl

反向DNAoligo（R）:1μl10退火Buffer：5μlddH2O：43μl

2）用石蜡膜将EP管口封好。

3）将EP管放入事先煮沸的电磁锅中，煮沸4min。

4）关闭电源，将电磁锅放入泡沫箱中保温。（为使温度缓慢下降，以便正反向oligo充分退火）

5）待锅中的水温降至常温，将EP管取出进行连接试验或置于-20℃冰箱中保存。

四．pSR-H1载体的XhoⅠ和BamHⅠ双酶切1）酶切体系（50μl）

pSR-H1质粒：5μgXhoⅠ（NEB）：2μlBamHⅠ（NEB）：2μlBamHⅠBuffer:5μlBSA(100):0.5μlddH2O:35.5μl

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2)混匀，用离心机将液体甩入管底。

3）37℃恒温水浴锅中反应过夜（至少12h，否则可能酶切不完全）。

五．酶切产物的胶回收（GE胶回收试剂盒）1）电泳：配制1%的琼脂糖凝胶，150V电泳45min.

2)切胶：用吸水纸将凝胶上的电泳液吸干，洁净的刀片在紫外灯下切出目的条带（胶块尽可能小）。

3）称量：将切好的胶块放入1.5ml的EP管中，称其重量并做好标记。

4）溶胶：用枪头将胶块搅碎，按100mg加100μl的capturebuffertype2的比例向EP管中加入capturebuffertype2，于60℃水浴中放置10min，期间颠倒离心管3次使胶块充分溶解。

5）离心：将溶胶液转至事先预备好的柱子中，放置3min，6000rpm离心1min。

6)洗涤：向柱子中加入