层粘连蛋白β1与尘肺病发病风险及其机制的初探

层粘连蛋白β1与尘肺病发病风险及其机制的初探尘肺病(pneumoconiosis)是由于长期吸入生产性粉尘并在肺内潴留而导致的以肺组织不可逆性纤维化为主的全身性疾病,是我国危害最严重、涉及人数最多的职业病,其中最常见的两种类型是矽肺(silicosis)和煤工尘肺(coalworkers’pneumoconiosis,CWP)。井下煤矿作业人群的煤工尘肺以混合性尘肺-煤矽肺为多见,占87.6%,单纯的矽肺病和煤肺病很少,分别为11.4%和1.0%。2013年我国共报告了新增尘肺病例23152例,占全年新发职业病的87.72%,其中95.2%是矽肺病和煤工尘肺。尘肺病发生发展的病因、机制复杂,难以完全阐明,尘肺病一个重要的病理特征是,细胞外基质大量沉积。其中层粘连蛋白是一类具有多功能域的基底膜非胶原糖蛋白,由α、β、γ链构成的异三聚体,参与基底膜骨架的组装,影响和调节细胞的粘附、迁移、分化、增殖等生物学行为,也参与细胞信号的传导。层粘连蛋白β1链(LamB1)由LAMB1基因编码,在体内分布广泛,参与组装至少7种层粘连蛋白亚型。LamB1是肺发育和维持正常功能所必需的,也被报道参与肾、肝纤维化过程。然而,关于LamB1与尘肺的研究报道较少。虽然长期粉尘暴露是尘肺病的主要病因,但相同暴露条件下,发病率、病变进展快慢及纤维化严重程度的差异提示遗传因素在尘肺的发生发展中起着重要作用。单核苷酸多态性是研究疾病遗传易感性的重要工具,可反应个体表型、疾病易感性及对药物、环境等影响因素反应的差异。前期对尘肺病进行的全基因组关联研究(GWAS),发现在LAMB1基因上一个多态性位点rs4320486与尘肺病的发生危险性存在着相关性。鉴于尘肺病发病机制复杂,目前尚无有效治疗,且缺乏人群特异的血清学指标,深入研究基因多态性与尘肺病间遗传易感性的关系,对建立有效的易感性筛查,提高粉尘接触人群的健康监护水平都具有实际意义。目的在前期对尘肺病进行的全基因组关联研究(gwas)的基础上,通过大样本的病例-对照研究验证lamb1rs4320486与尘肺病发生危险性间的关联;通过人群血清样本、细胞模型研究rs4320486位点突变对lamb1基因转录表达的影响;通过动物模型和体外细胞模型观察lamb1在纤维化过程中的动态变化及可能的调控机制,为揭示尘肺病发病机制、个性化预防及治疗提供线索。方法(1)对1091例cwp患者和1042例无尘肺接尘对照进行问卷调查,包括一般人口学资料、接尘史、家族史等,并采集空腹外周静脉血,采用taqman基因分型法对受试者基因进行分型;(2)构建包含rs4320486(c>t)不同等位基因的载体,建立细胞模型,采用双荧光素酶报告基因发检测不同等位基因对lamb1基因转录的影响;(3)采用酶联免疫吸附法(elisa)检测不同基因间、病例和对照间血清lamb1浓度;(4)收集正常人肺组织和纤维化人肺组织,qrt-pcr法检测组织中lamb1mrna表达水平的差异;(5)分别建立sio2和blm诱导的小鼠肺纤维化模型,对处理后不同时间截点的小鼠肺组织病理切片进行he染色,观察不同时间点肺纤维化发生发展情况,以确认模型成功建立;(6)分别提取各期小鼠肺组织蛋白和rna,检测lamb1、上皮标志物e-cadherin、及间质标志物α-sma蛋白及mrna水平的动态变化;(7)建立sio2处理hbe细胞模型和tgf-β1诱导nih-3t3细胞模型,诱导纤维化病变,通过westernblot和qrt-pcr法确认lamb1与上皮间质标志物的表达情况,细胞免疫荧光直观展示hbe、nih-3t3细胞中纤维化表达的变化;(8)通过抑制剂特异性阻断活化的信号通路,研究纤维化中调控lamb1表达的机制。(9)应用epidata对人群调查建立数据库,spss16.0、stata12.0、plink1.07用于数据的整理和统计分析。使用imagej进行westernblot条带灰度值扫描,图形由graphpad5.0软件完成。结果1.采用logistic回归分析,以cc基因型为参照,lamb1rs4320486ct/tt基因型可以显著降低cwp的发生危险性(p=0.001),调整年龄、累积粉尘暴露量(cde)、吸烟后or值为0.74,95%ci为0.62~0.88。携带t等位基因的个体发生cwp的危险性是携带c等位基因个体的0.76倍(p<0.001)。分层分析显示,ct/tt基因型降低cwp发生危险性的保护性效应,在年龄>68岁组、低cde组及吸烟组人群中更加明显。此外,采用cox回归分析不同基因型与cwp病例从接尘到发病间期的关联性,发现ct/tt基因型可以延缓cwp的发生(p<0.001)。2.从细胞和人群两个方面观察分析不同等位基因对lamb1表达的影响。转染rs4320486pgl3-c等位基因质粒的细胞荧光素酶相对活性显著高于转染pgl3-t组细胞(p<0.05),在hbe细胞中约为3.6倍,在mrc-5细胞中约1.2倍。此外,elisa检测48例接尘人员血清lamb1浓度显示,相同基因型下,病例组的血清浓度高于对照组;在同为病例或同为对照组中,cc基因型个体血清lamb1浓度均略高于ct/tt基因型个体。这些结果提示不同基因型会影响lamb1表达水平的。3.用qrt-pcr检测肺组织中lamb1的表达水平,发现cwp患者和特发性肺纤维化(ipf)患者肺组织中lamb1的表达水平显著高于正常人肺组织(p<0.05),分别是对照的2.7倍和2.3倍。4.在建立的blm和sio2诱导的c57bl/6小鼠两种肺纤维化模型中,小鼠肺组织lamb1与间质标志物-α-sma的蛋白与mrna水平均随着纤维化的发生发展呈进行性增高,而上皮细胞标志物-e-cadherin则呈下降趋势。5.在sio2处理hbe和tgf-β1处理nih-3t3的细胞实验中,进一步验证了在肺组织中发现的结果,处理后可观察到lamb1的蛋白水平和mrna水平均显著增加,且随着处理时间的延长,一直保持高水平。细胞免疫荧光更直观的展示,与对照组相比,两个处理组lamb1的表达强度和范围均增加。6.sio2处理hbe后pi3k-akt信号通路和tgf-β/smad信号通路中下游分子均有表达上调的趋势,给予pi3k抑制剂ly294002和tgf-β受体1拮抗剂(tβri)ly2157299后,p-akt、p-smad2和smad2表达下调,lamb1的蛋白水平也相应减少,尤其是在ly2157299抑制剂组。结论本研究发现lamb1基因启动子区多态性位点rs4320486的突变会降低cwp的发生危险