沙门氏菌检验

第三章食品中肠道致病菌检验

第一节沙门氏菌检验第二节志贺氏菌检验第三节致泻性大肠埃希氏菌检验第四节小肠结肠炎耶尔森菌检验第五节副溶血性弧菌检验第六节空肠弯曲菌检验1中华人民共和国国家标准GB4789.4—2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:Salmonella中华人民共和国卫生部发布2016-12-26发布2017-06-23

实施2

第一节沙门氏菌检验

ExaminationofSalmonella第一部分：沙门氏菌概述1、沙门氏菌致病性2、生物学特性第二部分：GB/T4789.4-20103、设备和材料（略）4、试剂和培养基5、检验步骤和原理6、快速检测3第一部分：沙门氏菌概述(IntroductionofSalmonella)1、致病性：

菌型多-2500多血清型；易感动物种类多，几乎各种动物都有沙病；病种多：菌型和动物不同，病不同，同种动物可以得多种沙病，如鸡。主要幼龄动物和小孩易感染。鸡白痢

eggsandsalmonella4

世界上最大的一起沙门氏菌食物中毒是1953年于瑞典，由吃猪肉而引起的鼠伤寒沙门氏菌中毒，7717人中毒，90人死亡。美国2010.1爆发沙门氏菌疫情，共有474人染病，造成6人死亡，当局怀疑与受污染的花生酱食品有关。英国官方机构2012.2.4发布，英国出现沙门氏菌疫情(纽波特沙门菌)，已致30多人感染，其中一人死亡。目前初步怀疑传染源是受病菌污染的西瓜，相关机构提醒民众注意饮食卫生。5简单介绍沙门氏菌引起的食物中毒

（1）沙门氏菌引起食物中毒的症状（2）中毒沙门氏菌的来源（3）沙门氏菌引起食物中毒条件（4）沙门氏菌引起食物中毒的致病机理(5)引起食物中毒沙门氏菌的主要血清型.hk/.../images/salmonella_ec.jpg6（1）食物中毒症状：五种类型

胃肠炎型类伤寒型类霍乱型类感冒型败血症型在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第二位

72004年Foodnet监控的感染性疾病实验室诊断15806病例中各传染性病原的种类8（2）中毒菌来源

沙门氏杆菌来源于人和动物的粪便

－－活体本身感染带菌－－胴体及产品污染带菌；

菌体主要通过动物性食品及其制品如肉、禽、蛋、奶、水产品及其制品引起食物中毒；

*大块食品内部菌和毒素未被杀死和破坏，食入后中毒；*菌体较少，但在是适宜条件下放置较久，菌体在食物中大量繁殖，食前未加热或加热不足。*加热不彻底，有残留菌，又放置时间较长。*直接进食的食物被二次污染

9（3）食物中毒条件

菌体：菌型、毒力、数量:活菌体数量，数量越多，发病几率越高,一般为2×105～1×108

cfu/g。机体：抵抗力，儿童、老人、体弱者和患其他病的人。10（4）致病机理：

*活细菌对肠粘膜的侵袭*肠毒素毒害作用www.idph.state.il.us/public/hb/hbsam.htm(5)引起食物中毒的主要沙门氏菌有：

伤寒沙门氏菌

(S.typhimurium)副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)

鼠伤寒沙门氏菌

(S.typhimurium)肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)主要通过污染的水传播主要通过污染的食物传播12Salmonellaisoneofthemostprevalentpathogensassociatedwithfoodborneillness.Itisthecauseofanestimated14millionillnessesannuallyinUSAalone(Lynchetal.2006).Inrecentdecades,proportionofsalmonellosisattributedtoSalmonellaentericasubspeciesentericaserovarEnteritidis(SalmonellaEnteritidis),relativetootherSalmonellaserovars,hasincreased.

Accordingtoa2001report(Guard-Petter2001),Enteritidisisthemostprevalentserovarimplicatedinverifiedcasesofsalmonellosisworldwide.ThemostcommonfoodsourceofEnteritidisiseggs.13Shelleggsarecommonlycontaminatedinaverticalmannerduringeggformationincolonizedhenoviduct,orhorizontallyviamigrationofsalmonellaethroughtheeggshellaftercontactwithcontaminatedsubstancessuchashenfaeces(Guard-Petter2001;CentersforDiseaseControlandPrevention(CDC)2003;Grijspeerdtetal.2005;Lynchetal.2006).

Internallycontaminatedeggs,obtainedfromnaturallyinfectedhens,maycontain≤10Salm.Enteritidispereggandthepathogenismostlikelylocalizedoutsidethevitellinemembraneorinthealbumensurroundingit(Humphrey1994;Humphreyetal.1991;Poppeetal.1992).Consumptionofeggsthatareraworundercookedandpoolingofeggs(acommonpracticeinrestaurantsandinstitutionalsettings)canincreaseriskofillness(CentersforDiseaseControlandPrevention(CDC)2003;Lynchetal.2006).142、沙门氏菌的生物学特性

*2.1形态与染色*2.2培养特性*2.3生化特性*2.4抗原构造与分类*2.5抗原变异*2.6抵抗力

152.1形态与染色

沙门氏菌是G-，无芽孢，周生鞭毛的短杆菌，但也有无动力的变种。

162.2培养特性

对营养要求不高，在营养琼脂上，一般条件下培养24h形成S型菌落。

17葡萄糖＋靛基质-乳糖－/×H2S+/-蔗糖-尿素酶-麦芽糖+明胶液化d甘露糖+在KCN中生长-山梨糖+苯丙氨酸脱氨酶-卫矛醇d丙二酸钠-/+水杨苷-赖氨酸脱羧酶+甲基红+精氨酸脱羧酶+/(+)V-P-鸟氨酸脱羧酶+沙门氏菌虽然近3000多个血清型，但绝大多数血清型的细菌生化特性非常一致。因此，生化特性对沙门氏菌的鉴定具有重要意义。2.3生化特性+阳性，（＋）迟缓阳性，×迟缓不规则阳性或阴性，－阴性，d有不同的生化型2.3生化特性根据生化特性，沙门氏菌属分为6个亚属，其中亚属I是生化特性典型的沙门氏菌，是常见的沙门氏菌。列举与检验有关的重要生化特性及与埃希氏菌属的区别项目沙门氏菌属（亚属I、II、IV、V、VI）亚利桑那属（亚属III）埃希氏菌属硫化氢＋91.6%＋98.7%-0乳糖-0.8%d61.3%+90.8%蔗糖-0.5%-4.7%d48.9%水苷-0.8%-4.7%d40.0%表沙门氏菌的重要生化特性及与埃希氏菌属的区别注：表中数字为阴性百分率；＋表示阳性；-表示阴性；d表示有不同的生化反应192.4抗原构造与分类（先看大书p5－6表）

沙门氏菌的抗原主要有三类：

*菌体抗原(O抗原)*鞭毛抗原(H抗原)*表面抗原(Vi抗原)

20(1)菌体抗原(O抗原)

存在于细胞壁最外层的多糖-类脂-蛋白质复合物，多糖部分决定O抗原的特异性，加热至100℃经2.5h不能被破坏，也不能被乙醇及0.1％石炭酸破坏。O抗原有许多不同的组成成分，用阿拉伯数字1，2，3，4，…，67表示，观已排到67位，但实际只有58种。

主要抗原：一种菌可含多种O抗原，其中一群细菌独有的，其他细菌则没有的。具相同O抗原的菌归为一个血清群，将整个沙门氏菌属分为42个群，A-Z和O51-O67表示,其中95%致病菌在A-F群中次要抗原：一些抗原是在两群或几群细菌所共有的。如1，5，12。21O群O抗原O群O抗原O群O抗原A1,2,12B1,4,5,121,4,12,27C16,7C26,8C38,20C46,7,14D11,9,12D29,46E23,10E33,5,34E41,3,19F11G11,13,22G21,13,23H1,6,14,241,6,14,25IJKLMNOPQRSTUVWXYZ1617182128303538391,40411,424344451,474850

其他O群1，1552535455565758596061626364656667沙门氏菌属O抗原表22(2)鞭毛（H）抗原－－分型依据

是存在于鞭毛上的不耐热蛋白质。沙门氏菌的H抗原有两种：

第1相(特异相)小写英文字母表示：a，b，c，…，z，z1，z2，

第2相(非特异相)，用阿拉伯数字表示：l，2，3，但少数也有用英文字母表示的，如l和w。看书P5－6的表

双相菌：具有两相H抗原的沙门氏菌称双相菌。大多数；

单相菌：只有一相H抗原的沙门氏菌称单相菌。少数。

每群(组)沙门氏菌根据H抗原不同分成不同菌型。23(3)Vi抗原：极少数沙门氏菌有.

极少数沙门氏菌含有Vi抗原，如伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌，Vi抗原是菌体表面荚膜多糖抗原，可阻止O抗原与O抗体的特异性凝集反应，Vi抗原不耐热，加热酒精灯加热煮沸100℃经5min/60℃30min即可破坏。血清型鉴定0抗原与O抗体的特异性凝集反应，如不凝集，须加热100℃5min后破坏Vi抗原，菌体抗原才能与O抗血清发生凝固。242.5抗原的变异

(1)H抗原的位相变异(2)菌落的S—R变异

(1)H抗原的位相变异

沙门氏菌第1相H抗原和第2相H抗原发生分离或位相变异第1相H抗原可以在第2相中发生，第2相H抗原也可以在第1相中发生的现象叫位相变异。如乙型副伤寒沙门氏菌的抗原式为b，1，2。如果我们挑取乙型副伤寒沙门氏菌在平板上划线分离培养，长出许多菌落，则一部分菌落只有第1相b，而另一部分菌落只有第2相1和2；

Hb，1，2b1，2分离培养分离位相变异25(2)菌落的S—R变异

沙门氏菌在人工培养基上经过多次传代，菌落由光滑型变为粗糙型，0抗原也随之消失，这样的菌株则不能用凝集试验分型检验。

26分类总结：生化特性不同分

6个亚属，Ⅰ－Ⅵ亚属菌体抗原(O抗原)，用阿拉伯数字1，2，3，4，···67（58），

具有相同O抗原的为一群，A.B.······Z,Z之后用O加下脚阿拉伯数字表示，如A群.B群.O1群、O2群、O3群等,其中95%致病菌在A,B,C,D,E,F六个群中。H抗原－－分型依据：

第一相(特异相)a，b，c，…，z，z1，z2，表示；第二相(非特异相)，l，2，3表示。按O抗原和鞭毛H抗原的不同，将沙门氏菌分为近2500个血清型27分类：

*肠杆菌科（Enterobacteriaceae）沙门氏菌属（Salmonella）

生化特性分为6个亚属

O抗原有58种,相同O抗原归为一群/组

按O抗原和鞭毛H抗原约分2500个血清型282.6抵抗力

沙门氏菌对热及外界环境的抵抗力属于中等；沙门氏菌对化学药品的抵抗力较弱；

胆盐、煌绿及孔雀绿等对本菌的抑制作用弱于大肠杆菌，常可用以制备选择性培养基；沙门氏菌属细菌对氯霉素敏感。29GB/T4789.4—2016代替GB/T4789.4—2010GB/T4789.4—2008食品安全国家检验食品微生物检验沙门氏菌检验NationalfoodsafetystandardFoodMicrobiologicalexamination:Salmonella第二部分：GB/T4789.4-201630前言本标准参考采用了国际分析家学会（AOACINTER－NATIONAL）AOACOfficialMethod967.26，967.27，967.28；国际标准化组织（ISO）ISO6579：2002；美国食品药品管理局（FDA）《细菌分析手册》第5章：沙门氏菌（2003年）（BacteriologicalAnalyticalManual,Chapter5:Salmonella,2003）。本标准代替GB/T4789.4—2010/2008《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》。本标准自实施之日起，GB/T4789.4—2010同时废止。31本标准与GB/T4789.4—2010相比主要变化如下：——修改了检测流程和血清学检测操作程序；——修改了附录A和附录B；

本标准与GB/T4789.4-2008相比，主要变化如下：——修改了标准的中英文名称；——修改了标准的范围；——修改了培养基和试剂；——修改了设备和材料；——修改了附录A。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。321规范本标准规定了食品中沙门氏菌的检验方法。本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。

332设备和材料

（新改的有，原有的部分略）2.4振荡器。2.5电子天平：感量（原来叫精确至）0.1g。2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。2.12全自动微生物鉴定系统343培养基和试剂

3.1缓冲蛋白胨水（BPW）：见第A.1章。

3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见第A.2章。3.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见第A.3章。

3.4

亚硫酸铋琼脂(BS)琼脂；3.5HE（HektoenEnteric）琼脂（含乳糖和蔗糖）3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见第A.6章。3.7沙门氏菌属显色培养3.8三糖铁（TSI）琼脂：见附录A中A.73.9蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A中A.83.10尿素琼脂（pH7.2）：见附录A中A.93.11氰化钾（KCN）培养基：见附录A中A.103.12赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.113.13糖发酵管：见附录A中A.123.14邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录A中A.133.15半固体琼脂：见附录A中A.143.16丙二酸培养基：见附录A中A.153.17沙门氏菌O和H诊断血清3.18生化鉴定试剂盒增菌液选择性平板生化试验管血清学实验35前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的细菌恢复活力；BPW选择性增菌：使沙门氏菌优势增殖，其它细菌受到抑制；选择性平板分离培养：BS+XLD/HE/沙氏显色培养基生化试验：鉴定分离出的细菌是否符合沙门氏菌的生化谱，可采用API20E等成套生化试剂血清学鉴定：特异性诊断血清鉴定到种4.GB/T4789.4-2016沙门氏菌检验程序多价血清学鉴定血清学分型（选做）

样品（20类）25g225mL乳糖肉汤（LB）or胰酪胨大豆肉汤（TSB）or煌绿溶液（BG）or通用前增菌肉汤（UPB）or营养肉汤（NB）or再造脱脂奶粉or四硫酸盐煌绿（TT）pH6.8±0.224±2h35℃RVTT43±0.2℃or35±2.0℃24±2h24±2h42±0.2℃BS&XLD&HE24±2h35℃TSI&LIA非沙门菌沙门菌非沙门菌LIA+LIA－TSIK/ALIA－TSIA/A尿素酶，H抗原（多价H抗血清或Spicer-Edwardsflagellar(H)test），赖氨酸脱羧酶，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN，丙二酸盐，吲哚），O抗原酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐（API20E,EnterotubeII,

EnterobacteriaceaeII,MICRO-ID,orVitekGNI）+O抗原&H抗原细菌学分析手册（FDA/BAM）沙门菌属肉、禽和蛋品中沙门菌的分离和鉴定USDA/FSISMLG4.02样品BPWorBPW（含结晶紫）35±1℃20-24hBGS&DMLIAorXLT442±0.5℃22~24h0.5±0.05mL＋10mLTT0.1±0.02mL＋10mLmRV42±0.5℃22~24h35±1℃18~24h&48hTSI&LIA血清学试验商业生化试剂盒或自动鉴定系统or传统生化鉴定报告结果

4.1前增菌：特别是菌体受损严重的样品4.2（选择性）增菌

4.3分离4.4生化试验鉴定到属：初步生化试验和进一步生化试验4.5血清学分型鉴定（用1.2%－1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原）菌型判定和结果报告4.操作步骤和原理394.1前增菌步骤称取25g（ml）样品放入盛有225mlBPW的无菌均质杯中，以8000－10000r/min均质1－2min，或置于盛有225mlBPW的无菌均质袋中，用拍击时均质器拍打1－2min。若样品为液态，需要均质，振荡混匀。如需要，用1M无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。如用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8～18h。

如为冷动产品，应在45℃以下不超过15min，或2℃-5℃不超过18h解冻。

增加拍击式均质器，均质袋可直接培养。目的－－复活、分离、增菌－－提高该菌检出率40复活/前增菌：用不加任何抑菌剂，无选择性的培养基－－缓冲蛋白胨水(BPW)进行增菌，使处于濒死状态的沙门氏菌恢复活力；

*沙门氏菌属最重要的病原菌，食品标准中规定不得含有*沙门氏菌在食品中的含量较少*食品加工过程使菌体损伤而处于濒死的状态414.2选择性增菌试验步骤轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转接于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h-24h。同时，另取1mL，转接于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h-24h。

AOAC：TT、SCFDA：RV、TTISO：RV、SC选择性增菌的目最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种选择性分离增菌液：一种是抑制除沙门氏菌以外其肠道菌的生长，一种是在不影响其他肠道菌生长的情况下促进沙门氏菌的生长。431）四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液-42℃胆盐和煌绿是抑G＋菌；硫代硫酸钠和碘反应生成四硫磺酸钠抑制大肠杆菌，沙菌有四硫磺酸酶，能解毒；碳酸钙起稳定硫代硫酸钠的作用配方1）基础液（900mL）蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化钠3.0g碳酸钙45.0g蒸馏水1000mL2）硫代硫酸钠溶液（100mL）3）碘溶液（20mL）4）0.05%煌绿水溶液（2mL）5）牛胆盐溶液（50mL）更适合于最适生长温度42℃的伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌两种以外的大多数沙门氏菌

44亚硒酸盐与硫化物形成硒硫化合物可起到抑杂菌作用；胱氨酸可促进沙门氏菌生长；2）亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液-36℃配方蛋白胨5.0g乳糖4.0g磷酸氢二钠10.0g亚硒酸氢钠4.0gL-胱氨酸0.01g蒸馏水1000mL更适合于伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌，最适生长温度36℃45SC亚硒酸盐胱氨酸增菌液TTB四硫磺酸钠煌绿增菌液MM氯化镁孔雀绿增菌液亚硒酸盐抑菌胱氨酸促生长四硫磺酸钠和煌绿抑菌氯化镁和孔雀绿抑菌适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长，36℃适合其他沙门菌生长，42℃，18-24h，为防漏检宜SC+TTB/MM表2常用选择性培养基比较4.3平板分离

---抑制杂菌和选择性鉴别培养基试验步骤分别用接种环取增菌液1环，划线接种一个在亚硫酸铋琼脂BS及木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂XLD/HE/沙门氏菌显色培养基划线，分离培养FDA：BS、XLD、HEAOAC：BS、XLD、HEISO：phenolredbrilliantgreen琼脂、BS或HE平板分离目的

为了最大可能的检出沙门氏菌，选择性鉴别平板上形成肉眼可见的典型菌落，原则上必须使用两种以上选择性分离培养基。47沙门氏菌在亚硫酸铋琼脂(BS琼脂)上典型特征

菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变

亚硫酸铋BS配方蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g葡萄糖5.0g硫酸亚铁0.3g磷酸氢二钠4.0

g煌绿0.025g柠檬酸铋铵2.0g亚硫酸钠6.0g琼脂20g蒸馏水1000mLpH7.548HE配方蛋白胨12.0g牛肉膏3.0g蔗糖12.0g乳糖12.0g水杨素2.0g胆盐20.0

g氯化钠5.0g琼脂20g蒸馏水1000mL0.4%溴麝香草酚蓝溶液

16mlAndrade指示剂20ml甲液20ml乙液20mlpH7.549沙门氏菌在HE琼脂上典型特征蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色

沙门氏菌在XLD琼脂上典型特征沙门氏菌在35℃培养24-48小时后，粉红色/黄色菌落有或无黑色中心。

XLD配方酵母膏3.0gL-赖氨酸5.0g木糖3.75g乳糖7.5g蔗糖7.5g去氧胆酸钠2.5g柠檬酸铁铵0.8g硫代硫酸钠6.8gNaCl5.0g琼脂20g酚红0.08g蒸馏水1000mLpH7.550BBL™CHROMagar™SalmonellaMediumReceivesAOAC-RIApproval

5152I-SS65.3I-SS-M81.0C-SS52.0I-HE83.2C-HE80.0I-XLD83.0C-XLD86.2I-BS106.6C-BS77.7CHRO68.4C-DHL98.4C-WS71.6TSA（对照）100.0I：进口C：国产53选择性鉴别培养基：在培养基中加入的指示系统主要是使沙门氏菌和杂菌（经选择增菌，余下的主要是埃希氏菌属）的菌落特征最大限度地区分开。

2个指示剂系统：乳糖指示系统

硫化氢指示系统54沙门氏菌：不分解乳糖，指示剂不变色，菌落不变色；埃希氏菌属：分解乳糖产酸，指示剂变色，菌落变色。（1）乳糖指示系统根据沙门氏菌属和埃希氏菌属生化特性，在鉴别培养基中加入乳糖和酸碱指示剂作为乳糖指示系统。55（2）硫化氢指示系统

大部分沙门氏菌亚属Ⅲ，即亚利桑那菌都能分解乳塘，这样光靠乳糖指示系统不能将亚属Ⅲ和埃希氏菌属区别开来，因此，要将亚属Ⅲ和埃希氏菌属区别开，必须再增加一个指示系统，即硫化氢指示系统。因为亚属Ⅲ绝大部分硫化氢试验阳性，而埃希氏菌属硫化氢试验阴性。硫化氢指示系统中有含硫氨基酸及二价铁盐，亚属Ⅲ分解含硫氨基酸产生硫化氢．硫化氢与铁盐反应生成硫化铁(FeS)黑色化合物，因此菌落为黑色或中心黑色。乳糖指示系统主要是为了分离沙门氏菌亚属I，Ⅱ，Ⅳ，V，Ⅵ

硫化氢指示系统主要是为了分离亚属Ⅲ。总之，既能分解乳糖又能产生硫化氢的即为沙菌亚属Ⅲ56主要杂菌为大肠埃希氏菌，而两者区别在于是否发酵乳糖，故加入乳糖、酸碱指示剂来判断可以菌落。加入硫化氢是因为第III属产硫化氢而缓慢发酵乳糖BS选择性最强，可延长时间以免沙门氏菌生长已被抑制多采用BS搭配XLD/HE/DHL/SS/WS等，互补防漏检。指示系统指示效果及可疑菌落特点BS葡萄糖＋H2S菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变XLD乳糖＋H2S菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心HE乳糖＋H2S蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色WS乳糖＋H2SDHL乳糖＋H2S无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色SS乳糖＋H2SCHR-紫红色样品+BPW+SC+HE样品+BPW+SC+XLD样品+BPW+SC+CHRO猪肉样品沙门氏菌的平板分离样品+BPW+SC+BS4.4生化鉴定挑取两个以上典型或可疑菌落，接种TSI琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺，同时接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板（NA）。

还可直接接种蛋白胨水、尿素琼脂、氰化钾培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。经TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的选择后，可筛掉大部分非沙门氏菌株，大大减少了工作量，同时也满足了API20E

或VitekGNI

鉴定的需要。59三糖铁（TSI）反应原理原理：三糖利用，是否产硫化氢培养基：高层斜面接种方式：划线穿刺结果：产酸/碱、产气、硫化氢乳糖(10g/L）蔗糖(10g/L)葡萄糖(1g/L)TSI配方蛋白胨20.0g牛肉膏5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亚铁铵0.2g硫代硫酸钠0.2g酚红0.25gNaCl5.0g琼脂20g蒸馏水1000mLpH7.5若分解H2S则产生黑色FeS沉淀，若分解糖类产气则可见气泡或裂缝只有斜面和底层均产酸，且赖氨酸脱羧酶阴性者才可排除为沙门氏菌的可能性其余情况即可能是也可能不是沙门氏菌属的细菌三糖铁（TSI）反应模式及意义葡萄糖乳糖蔗糖说明＋＋＋分解糖类产酸→pH↓→指示剂变黄→斜面底层均产酸变黄为A/A模式＋－－斜面因葡萄糖含量少故分解完后利用蛋白胨产碱且大于酸量故由黄变为深红，为K，底层无氧故缓慢分解葡萄糖而产酸变黄为A，K/A模式＋－＋由于乳糖或蔗糖量大，故斜面和底层均产酸变黄，亦为A/A模式＋＋－表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果622.本标准也保留了可以同时直接接种蛋白胨水

(供做靛基质试验)、尿素琼脂

(pH7.2)、KCN培养基的内容。本部分还增加了对疑似菌落进行留样确认的部分，以备必要时复查，这对生化鉴定不确定的菌落进行进一步验证是非常必要的。3.采纳API20E

或VitekGNI

为传统生化鉴定方法的选择性替代方法”。63/.../weishengwu/4-25-3-3-6.php2.1蛋白胨水＋靛基质试剂：见A.8章靛基质试验绝大多数沙菌：阴性

－/（＋）

目的：肠杆菌科细菌的鉴定。原理：有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。642.2尿素琼脂(pH7．2)：见A.9章。尿素酶试验，绝大多数沙菌：阴性－/（＋）

目的：通过分析尿素酶来进行肠杆菌科细菌的鉴定。原理：细菌产生的尿素酶分解尿素产生大量的氨，使培养基pH升高，用酚红指示剂测出。652.3氰化钾(KCN)培养基：见A.10章。绝大多数沙菌：阴性－2.4赖氨酸脱羧酶试验培养基：见A.11章。绝大多数沙菌：阳性＋反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾赖氨酸脱羧酶A1+---+A2++--+A3----+/-注：+阳性；-阴性；+/-阳性或阴性表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

p466

必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。表5沙门氏菌属各生化群的鉴别项目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ卫矛醇++--+-山梨醇+++++-水杨苷---+--ONPG--+-+-丙二酸盐-++---氰化钾（KCN）---++-注：+表示阳性；-表示阴性672.7半固体琼脂：见第A.14章。

（供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。

一般用1.5％的，不凝集时用2.5％-3％的；有Vi时酒精灯火焰煮沸。H抗原发育不好时，用0.7％-0.8%上菌落的边缘部分，或0.3％-0.4%远端取菌。）

2.8丙二酸钠培养基：见第A.15章。

（沙菌生化群鉴别培养基，用新鲜的琼脂培养物接种，于36℃±l℃

培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。）（沙菌Ⅲ和Ⅴ为阳性＋：由绿变兰；ⅠⅡⅣⅥ群为阴性－）68API20E生化鉴定系统3.1API20E生化鉴定试剂盒或VITEKGNI+生化鉴定卡11.API生化鉴定系统是法国梅里埃生物公司出品的微生物生化检测系列产品，原理是利用细菌对于各类化学物质（碳水化合物、氨基酸及蛋白质、无机盐等）的代谢能力以及酶类的存在与否等生化特性来鉴定细菌的一种方法，当反应能够导致反应体系的pH变化或产生显色物质，加入合适的酸碱指示剂或显色剂就可以反应出来。API试验的本质就是利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，常用于细菌的鉴别。69702.VITEK全自动微生物鉴定系统

试验2-6h能出报告。判断是某种菌的可能性是百分之几。有时也需要进行其他一些试验来进一步确定，比如血清学反应等。虽然该仪器是全世界比较好的，但因微生物鉴定工作的特殊性，其仍不能完全代替人工。

VITEK系列全自动微生物分析系统是法国biosMerieumx生产的全自动微生物分析仪的一个系列，包括：VITEK-32、VITEK-60、VITEK-120等。71VITEK自动化微生物分析仪的组成VITEK自动化微生物分析仪由充填机/封口机、读取器/恒温器、电脑主机及打印机组成充填机/封口机3min内把样本注入试验卡中及封口；读取器/恒温箱自动恒定培养温度并同时读取卡内生化反应变化（系统依据不同型号，容纳32至480张卡不等）；电脑主机负责分析资料的储存、系统的操作及分析程式的运作。72仪器的原理就是我们进行细菌鉴定中使用的生化反应。不过仪器把30个对细菌鉴定必需的生化反应培养基固定到卡片上，然后通过培养后仪器对显色反应进行判断，利用数值法进行判定;根据需要鉴定的微生物种类不同，设计了不同的鉴定卡片，比如革兰氏阴性菌卡，革兰氏阳性菌卡，酵母菌卡等。一般步骤

1．在试卡上填上标本号，VITEK会自动识别此号码。2.将菌落分离，加盐水后利用一支L型吸管，准备将菌液传送3．将试卡放入充填器，用真空原理，菌液会吸进试卡的每个小孔内，将底物溶解，然后封口。

4．将鉴定或药敏试卡放入培养/读数箱内。5．最快可在插入试卡1h后，打印初步报告。

最终报告在试验完成后自动打印出来优点快速：鉴定结果与传统方法的18-24h相比,平均只需4-6h。对与快速生长细菌(大肠埃希氏、粪肠球菌、变形杆菌、克雷伯氏菌等)鉴定可提前到2h;操作简便：

全部操作自动化，只须操作基本步骤，简单而方便；使用灵活：

随时放入试卡进行测试，VITEKSR测试容量可扩充由32至480张卡75准确可靠：

一般常见的细菌均可准确的鉴定出来，SRF软件可使工业用户扩展鉴定数据库。资料处理：

bioLIAISON软件集中管理实验室资料，设计报告形式、产品数据、鉴定结果及其他试验结果的处理。此软件可额外配套统计及质控软件。

获得AOAC国际认证：

保证提供的微生物鉴定结果是公认的76生物梅里埃VITEK32微生物鉴定及药敏分析系统VITEK®2Compact

/jyk/instrument/jyk_micro-vitek-32.htm771.原理：免疫学原理

直接凝集反应－－玻片凝集反应玻片凝集反应：是一种常规的定型试验方法，用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。将含有抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分钟后若出现肉眼可见的凝集块，即为阳性反应，证明该菌是沙门氏菌。

此法快速、简便，但不能进行定量测定。4.5血清学鉴定78（2）抗体和抗原步骤：先多价后单价，先常见的后不常见的，先O后H，根据结果查表得到鉴定菌种多价血清：含多种抗体的血清，如A-F多价单价血清：含单一抗体的血清抗原准备：一般采用1.2-1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。若O血清不凝集可转种至高含量（2.5-3%）琼脂培养基上，干燥有利于O-Ag发育。792.O抗原的检测

先用9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。9种多价O血清：O多价1A，B，C，D，E，F群（并包括6，14群）O多价213，16，17，18，21群O多价328，30，35，38，39群O多价440，41，42，43群O多价544，45，47，48群O多价650，51，52，53群O多价755，56，57，58群O多价859，60，61，62群O多价963，65，66，67群80具体步骤：A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水自凝者为粗糙形菌株，不能分型。被A～F多价O血清（混在一起的）凝集者，依次用群因子血清做凝集试验，根据试验结果，判定O群：

O4(B群)；O3、O10（E群）；O7（C1群）；

O8（C2群）；

O9（D群）；O2（A群）和O11（F群）。血清被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群；每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。81图玻片凝集法步骤先应在玻片上滴加1滴生理盐水，加入菌苔做阴性对照并观察是否自凝，若有则说明该菌株发生S-R变异失去了O抗原成为粗糙型，故不能进行血清学分型。H抗原的鉴定属于A～F各O群的常见菌型，依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。

表6A~F群常见菌型H抗原表836结果与报告

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（ml）样品中检出或未检出沙门氏菌。85－检验步骤：五步法，约需4－5d2.选择性增菌：使沙门氏菌优势增殖，其它细菌受到抑制；3.选择性平板分离培养：BS+XLD/HE/显色培养基4.生化试验：鉴定分离出的细菌是否符合沙门氏菌的生化谱，可采用API20E等成套生化试剂5.血清学鉴定：特异性诊断血清鉴定到种1.前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的细菌恢复活力；复习题一、填空1、肠杆菌科的沙门氏菌属中细菌的分类是按生化特性分为6个亚属，用Ⅰ，Ⅱ～Ⅵ表示

，亚属Ⅲ习惯上也叫亚利桑那菌；其中每种菌含2种以上有鉴别意义的菌体抗原（O抗原）具有相同的O抗原的菌种归为一群，其中95%致病菌在A～F群中；按O抗原和鞭毛H抗原的不同分为近2500

个血清型。2、食物中毒症状：五种类型即胃肠炎型、类伤寒型、类霍乱型、类感冒型和败血症型。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第二位。引起沙门氏菌食物中毒的主要