Weastern Blot 操作方法 图文

蛋白质免疫印迹技术为什么要作蛋白质印迹实验？

目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析WesternBlot简介WesternBlot一般流程WesternBlot常见问题分析单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。原理：在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测WesternBlot简介。1、蛋白样品的制备2、SDS3、转膜4、封闭5、一抗杂交6、二抗杂交7、底物显色WesternBlot流程通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白1.1蛋白样品的提取1、蛋白样品的制备1.2蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。BCA法R值1.3蛋白样品的变性2×SDS上样缓冲液：1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚蓝0.2g总体积100mlSDS

是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。2.1基本原理2、SDS电泳

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聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。2.2凝胶成分丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺

SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵Tris-甘氨酸电泳缓冲液单体：丙烯酰胺（Acr）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；产物：三维网状结构凝胶2.3凝胶浓度与蛋白分离范围SDS浓缩胶(5%Acrylamide)及分离胶配方表：/sdskit.htm

作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小灌制分离胶隔绝空气灌制积层胶插入梳子

StakinggelSeparatinggel电泳条件：推荐：浓缩胶80V15——25min

分离胶120V60——80min2.3marker的选择预混分子量标准高分子量标准低分子量标准宽分子量标准预染分子量标准单色预染多色预染修饰分子量标准原因：校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差种类：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin用法：二抗孵育时加入HRP标记内参抗体分子量大小相差比较明显

2.4内参的选择要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。3、转膜3.1膜的选择湿转半干转半干式转膜速度快，适合与小分子量蛋白湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白两种方法的转膜液不同！！方法仪器特点4、封闭为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，常用的封闭液：脱脂奶粉（5％）封闭条件：室温封闭1hour，再用TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。5-6、一二抗杂交把PVDF膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，按照抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释抗体；摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次15min。加入TBST配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次15min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。7、底物显色显色方法代表类型特点酶促底物发光法DAB显色法稳定性好，灵敏度较高（250pg），背景一般，成像性较差，药品疑有一定致癌性。

化学发光法（推荐使用）ECL发光法稳定性好，灵敏度高（10-12g），背景可以很低，成像性好，且可以重复标记，暗室操作！A液B液11:

膜混合ECL工作液滴加ECL工作液

显影、定影目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。WesternBlot常见问题分析SDS电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入AP和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适SDS电泳转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温转移到膜上的蛋白很少蛋白分子量<

10KDSDS浓度不合适凝胶太厚

原因对策蛋白分子量<10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜在阴极buffer中加入0.005-0.01%SDS可提高转膜效率延长转膜时间膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高

原因对策转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的工作浓度背景太高杂交信号很弱抗体保存不当抗原不充足膜的漂洗过度

原因对策抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照减少漂洗的时间和次数一抗不是唯一特异的二抗出现非特异结合

原因对策制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合出现非特异带FurtherReadings生物秀WesternBlotti