医疗器械无菌和初始污染菌检验

医疗器械无菌和初始污染菌检验国家食品药品监视管理局北京医疗器械质量监视检验中心用于检查要求无菌的医疗器械能否无菌的一种方法。假设供试品符合无菌检查法的规定，仅阐明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。无菌实验的目的：将医疗器械或其浸提液接种于培育基内，以检验供试品能否有细菌和真菌污染。什么是无菌检查法？医疗器械无菌检验规范GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学实验方法2021年版<中国药典>无菌检查法医疗器械无菌实验检查要点指南〔2021版〕无菌检验是无菌医疗器械产品消费控制过程中的一项重要内容。其检验方法、检验结果断定及检验人员业务才干等要素直接影响产品的质量和平安。作为无菌医疗器械消费企业，其无菌检验任务应由本企业独立完成。并要求企业的检验人员能当场操作或口述无菌检验的过程。

培育基:是人工配制的生物营养物质，即用人工的方法将多种物质按各种微生物生长繁衍的需求配成的一种混合营养物。微生物:必需用光学显微镜或电子显微镜才干察看到的微小生物。微生物具有一定的形状与构造,并能在适宜的环境中迅速地生长和繁衍,如细菌、病毒、真菌等。无菌：是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。凡能杀灭物体中一切活的微生物的作用称为灭菌。

细菌：为单细胞微生物,其细胞分化不完善，无完好细胞核及核膜、核仁，直径普通为1μm~10μm。

真菌：为多细胞或单细胞微生物，其细胞分化完善，有细胞核和各种细胞器，故易在体外生长繁衍，直径普通为10μm~100μm。医疗器械无菌检验所需设备超净任务台医疗器械无菌检验所需设备恒温培育箱〔至少2台〕医疗器械无菌检验所需设备压力蒸汽灭菌器医疗器械无菌检验所需设备电热枯燥箱医疗器械无菌检验所需设备集菌仪医疗器械无菌检验所需设备生物平安柜:〔从实验平安性思索，建议阳性对照实验运用生物平安柜〕医疗器械无菌检验所需设备电子天平医疗器械无菌检验所需设备光学显微镜医疗器械无菌检验所需设备过滤安装〔无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子〕无菌检查应在环境干净度10000级下的部分干净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进展，其全过程必需严厉遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、任务台面及环境应定期按<医药工业干净室〔区〕悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法>的现行国家规范进展干净度验证。隔离系统按相关的要求进展验证，其内部环境的干净度须符合无菌检查的要求。无菌检查人员必需具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。还应该具有高度的责任心和严谨细致的任务作风。环境及人员要求

无菌检查法环境要求隔离系统无菌检查法环境要求无菌室在消毒处置终了后，应检查空气中的菌落数。无菌检查法环境要求TSA琼脂平皿在30℃~35℃培育48h证明无菌取3只放无菌操作台或超净任务台平均位置翻开上盖，暴露30min后盖好3只培育皿上生长的菌落数平均应不超越1个无菌实验过程中也应检查空气中的菌落数，方法要求同上无菌检查法实验前预备器具灭菌：与供试液接触的一切器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min，或置电热枯燥箱内160℃2h。培育基：可按药典中的处方制备培育基，亦可运用按该处方消费的符合规定的脱水培育基。应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培育基应保管在2℃~25℃，普通在3周内运用。无菌检查法实验前预备配制培育基所需器具:

无菌检查法实验前预备常用器具与稀释液:

无菌检查法实验前预备培育基:

无菌检查法实验前预备硫乙醇酸盐流体培育基:在供试品接种前,培育基氧化层的高度不得超越培育基深度的1/5，否那么,须经100℃水浴加热至粉红色消逝〔不超越20分钟〕迅速冷却,只限加热一次，并应防止被污染。其装量与容器高度的比例应符合培育终了后培育基氧化层〔粉红色〕不超越培育基深度的1/2。30℃~35℃培育14天。需氧菌生长厌氧菌生长无菌检查法实验前预备培育基:

无菌检查法实验前预备

改良马丁培育基：23℃~28℃培育14天无菌检查法实验前预备培育基:

无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培育基及改良马丁培育基等应符合培育基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。

无菌性检查

每批培育基随机不少于5支〔瓶〕，培育14天，应无菌生长。培育基的适用性检查灵敏度检查：

菌种

培育基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超越5代〔从菌种保管中心获得的冷冻枯燥菌种为第0代〕，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证实验菌株的生物学特性。金黄色葡萄球菌〔Staphylococcus

aureus)［CMCC〔B〕26

003］

铜绿假单胞菌

(Pseudomonas

aeruginosa)

［CMCC〔B〕10

104］

枯草芽孢杆菌

(Bacillus

subtilis

)

［CMCC〔B〕63

501］

生孢梭菌

(Clostridiumsporogenes)

[CMCC(B)

64

941]

白色念珠菌

(Candidaalbicans)

[CMCC(F)

98

001]黑曲霉

(Aspergillus

niger

)

[CMCC(F)

98

003]培育基的适用性检查培育基应符合无菌性检查及灵敏度检查的要求。检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进展。灵敏度检查所用菌种〔药典2021版规定〕金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉分别接种各菌种新颖培育物至相应培育基中培育，将培育物用0.9%无菌氯化钠溶液制成菌悬液〔浓度小于100cfu/mL〕硫乙醇酸盐流体培育基〔12mL〕9支：分别接种小于100cfu的金葡、铜绿、枯草、生孢各2支，另一支不接种做空白对照，培育3天改良马丁培育基〔9mL〕5支：分别接种小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，另1支不接种做空白对照，培育5天逐日察看结果：空白对看管应无菌生长，假设加菌的培育基管均生长良好，那么灵敏度符合规定。无菌检验有两种方法：直接接种法、薄膜过滤法直接接种法:将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培育基内培育。薄膜过滤法:含抗菌、抑菌成分的供试品会抑制某些微生物的生长繁衍,所以用常规方法检查会出现假阴性的结果,但并不等于产品中没有微生物甚至是致病性微生物。所以采用薄膜过滤法来去除供试品中可溶的抑菌性成分,把细菌等微生物截留在滤膜上,然后再经过处置培育使所含微生物生长繁衍,从而使微生物检出。方法验证实验当建立产品的无菌检查法时，应进展方法的验证，以证明所采用的方法适宜于该产品的无菌检查。假设产品的组分或原检验条件发生改动时，检查方法应重新验证。

验证时，按“供试品的无菌检查〞的规定及以下要求进展操作。对每一实验菌应逐一进展验证。方法验证实验菌种及菌液制备：除大肠埃希菌〔Escherichiacoli〕[CMCC(B)44102〕外，金黄色葡萄球菌

、

枯草芽孢杆菌

、

生孢梭菌、

白色念珠菌、黑曲霉同培育基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。方法验证实验与灵敏度检验一切菌种区别：大肠埃希菌替代铜绿假单胞菌。方法验证实验取每种培育基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中参与小于100cfu的实验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培育基或改良马丁培育基中，或将培育基加至滤筒内。另取一装有同体积培育基的容器，参与等量实验菌，作为对照。按规定温度培育3天~5天。各实验菌同法操作。方法验证实验：薄膜过滤法方法验证所用菌种〔药典2021版规定〕金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉分别接种各菌种新颖培育物至相应培育基中培育，将培育物用0.9%无菌氯化钠溶液制成菌悬液〔浓度小于100cfu/mL〕硫乙醇酸盐流体培育基8支：分别接种小于100cfu的金葡、大肠、枯草、生孢各2支，其中1管接入每支培育基规定的供试品接种量，另1管作为对照，培育3天。改良马丁培育基4支：分别接种小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，其中1管接入每支培育基规定的供试品接种量，另1管作为对照，培育5天。方法验证实验：直接接种法与对看管比较，如含供试品各容器中的实验菌均生长良好，那么阐明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检查条件进展供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，那么阐明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用添加冲洗量，或添加培育基的用量，或运用中和剂或改换滤膜种类等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进展方法验证。

方法验证实验也可与供试品的无菌检查同时进展。方法验证实验：结果判别供试品包装须完好无损，尤其是只需一层包装的样品。进入无菌检验室的样品假设有两层〔或两层以上〕包装的，需将外包装在传送窗〔或缓冲间〕撤除后，传入实验室。

操作人员预备：带口罩、帽子、穿公用无菌服、鞋进入无菌室。供试品的无菌检查

供试品的无菌检查在100级超净台内，酒精灯火焰周围，以无菌操作法将规定量的供试品分别接种至含硫乙醇酸盐流体培育基〔不少于15ml/管〕和改良马丁培育基〔不少于10ml/管〕的容器中。正确的无菌操作，既不能引入外来菌污染培育物呵斥假阳性，也要留意接触供试品的实验器具温度不可过高以免将能够存在的菌烫死。阴性对照〔目的是验证实验能否存在污染〕：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。阳性对照〔目的是验证实验可靠性，防止假阴性〕：应根据供试品特性选择阳性对照菌；无抑菌作用供试品以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。阳性对照实验的菌液制备同方法验证实验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培育基接种的样品量。阳性对看管培育48~72小时应生长良好。供试品的无菌检查无菌检查法-直接接种法供试品数量：同一批号3个~11个单位供试品优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培育基内培育。如：棉签、导尿包中的导尿管、注射器中的液体等无菌检查法-薄膜过滤法2021年版<中国药典>规定:只需供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法一样。在蠕动泵的作用下，被测产品经过装有带空气过滤器的针头及无菌管路直接从样品容器中进入滤筒中，免去了通常膜转移过程中易产生的污染。无菌检查法中薄膜过滤法所用的滤膜孔径应不大于0.45μm，直径约为50mm。水溶液供试品取规定量的供试液，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立刻过滤。供试液经薄膜过滤后，假设需求用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超越1000mL，以免滤膜上微生物受损伤。无菌检查法-薄膜过滤法冲洗后分别将100mL硫乙醇酸盐流体培育基及改良马丁培育基参与相应的滤筒内，培育。无菌检查法培育及察看上述含培育基的容器按规定的温度培育14天。培育期间应逐日察看并记录能否有菌生长。如在参与供试品后或在培育过程中，培育基出现浑浊，培育14天后，不能从外观上判别有无微生物生长，可取该培育液适量转种至同种新颖培育基中，细菌培育2天、真菌培育3天，察看接种的同种新颖培育基能否再出现浑浊；或取培育液涂片，染色，镜检，判别能否有菌。假设供试品管均廓清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；假设供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明实验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。实验假设经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，假设无菌生长，判供试品符合规定；假设有菌生长，判供试品不符合规定。阳性对看管应生长良好，阴性对照不得有菌生长。否那么，实验无效。无菌检查法结果判别

当符合以下至少一个条件时，方可判实验结果无效：

〔1〕无菌检查实验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；

〔2〕回想无菌实验过程，发现有能够引起微生物污染的要素。

〔3〕供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌实验中所运用的物品和〔或〕无菌操作技术不当引起的。无菌检查法结果判别实验假设经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，假设无菌生长，判供试品符合规定；假设有菌生长，判供试品不符合规定。无菌检查法结果判别医疗器械无菌实验检查要点指南〔2021版〕

由于无菌检验时间跨度较长，因此过程的记录应可以完好表达实验的全过程，对于在实验过程中出现的各种情况，均应在记录中客观反映。

直接接种法实验结果

薄膜过滤法实验结果

无菌检查法断定实验报告中宜给出以下信息：供试品称号；消费批号和〔或〕灭菌批号；供试液制备方法；接种方式；每日察看结果〔包括阴、阳性对照〕；结果断定实验报告GB15979-2002一次性运用卫生用品卫生规范初始污染菌的检验初始污染菌：产品消毒、灭菌前的细菌总数，可判明检品受细菌污染的程度以及消费单位所用的原料、工具设备、工艺流程、消费人员的卫生情况，是对检品进展卫生学评价的综合根据。部分一次性运用卫消费品微生物学目的要求产品种类微生物指标初始污染菌cfu/g细菌菌落总数cfu/g或cfu/mL大肠菌群致病性化脓菌真菌菌落总数cfu/g或cfu/mL口罩普通级消毒级—≤10000≤200≤20不得检出不得检出不得检出不得检出≤100不得检出尿布等普通级消毒级—≤10000≤200≤20不得检出不得检出不得检出不得检出≤100不得检出注：致病性化脓菌指绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌与溶血性链球菌。初始污染菌的检验预备：平皿洗净、烘干；牛皮纸包好灭菌营养琼脂培育基配制、灭菌。步骤：采样，供试液制备，培育，菌落计数在100级净化条件下用无菌方法翻开至少3个包装；从每个包装中取样，准确称取10g±1g样品；剪碎后参与200mL无菌生理盐水中，充分混匀。液体产品用原液直接做样液。初始污染菌的检验取上清液共接种5个平皿，每个平皿中参与1mL供试液用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂培育基〔15~20〕mL，倒入每个平皿内混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿置35℃±2℃培育48h后，计算平板上的菌落数。稀释度5细菌菌落总数=5块平板上的细菌菌落总数×〔cfu/g或cfu/mL〕如：取10g样品入200mL生理盐水中，那么稀释20倍当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字。初始污染菌的检验计数方法：将平板置菌落计数器或从平板的反面直接以肉眼用标志笔点计，以投射光衬以暗色背景，仔细察看，计数。必要时可以借助于放大镜、菌落计数器。菌落特征：⑴形状特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黄色。⑵边缘整齐或不整齐，外表有光滑、粗糙，皱褶、突起或扁平。⑶大小差别很大。初始污染菌的检验假设样品菌落总数超越本规范的规定，应将留存的复检样品依前法复测2次，2次结果平均值都到达本规范的规定，那么断定被检样品合格；其中有任何一次结果平均值超越本规范的规定，那么断定被检样品不合格。医疗器械的无菌和初始污染菌检验相关规范GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学实验方法2021年版<中国药典>无菌检查法GB15979-2002一次性运用卫生用品卫生规范GB/T15980-1995一次性运用医疗用品卫生规范YY0033-2000无菌医疗器具消费管理规范〔1〕培育基配制记录〔2〕灭菌器、天平等仪器的运用记录〔3〕培育基无菌性检查、灵敏度检查记录〔4〕菌种购买、传代、运用记录〔5〕方法学验证记录〔6〕无菌实验记录〔7〕灭菌物品制造〔8〕废弃物处置记录〔9〕干净间监测记录医疗器械无菌检验应有记录一、适用范围二、检查内容1.选择的无菌检验方法2.检验人员资质3.现场察看无菌实验室环境4.设备和器具5.管理制度、操作规程等相关技术文件6.查阅实验记录三、其它应留意的问题医疗器械无菌实验检查要点指南〔2021版〕〔1〕培育基制备〔2〕供试品的无菌检查〔3〕培育及察看〔4〕结果判别〔1〕样品记录〔2〕灭菌物品制造记录〔3〕原始实验记录〔4〕废弃物处置记录医疗器械无菌实验检查要点指南〔2021版〕其它应留意的问题还包括：消费企业应确保样品具有代表性：实验样品应从常规产品中可以代表加工过程和条件的批中选择。选择样品是随机的。实验样品的选择和处置技术应明确，以免对样品上所含的微生物的数量和种类呵斥污染和改动。实验样品可以选择制造过程中的不合格产品，它们应该代表这个消费批的加工程序和条件。用于实验的不合格产品应不会影响无菌测试的有效性。医疗器械无菌实验检查要点指南〔2021版〕其它应留意