【积雪草提取物的质量实验研究8400字（论文）】

-19-积雪草提取物的质量实验研究目录3054第一章前言 -1-3112第二章材料 -4-8712.1材料与试液 -4-320892.2主要仪器 -4-23079第三章试验方法 -5-263053.1样品处理 -5-38623.2试验方法 -5-179463.2.1对照品溶液的制备 -5-4333.2.2供试品溶液的制备 -5-69003.2.3积雪草总苷标准曲线的制备 -5-249003.2.4积雪草中积雪草苷的含量测定 -5-136923.2.5积雪草中积雪草苷的提取率计算 -5-274093.3单因素试验 -6-318813.3.1乙醇浓度的单因素试验 -6-58023.3.2料液比的单因素试验 -6-279303.3.3超声时间的单因素试验 -6-25593.3.4提取次数的单因素试验 -6-262753.4正交试验 -6-15086第四章结果与分析 -7-130174.1积雪草苷标准曲线 -7-47044.1.1精密度试验 -7-278794.1.2重复性试验 -7-177124.1.3稳定性试验 -7-192414.2单因素实验结果分析 -8-310924.2.1乙醇浓度对积雪草苷提取率的影响 -8-102084.2.2超声时间对积雪草苷提取率的影响 -8-171204.2.3料液比对积雪草苷提取率的影响 -8-185674.2.4提取次数对积雪草苷提取率的影响 -8-59694.3正交试验结果分析 -8-83544.4正交试验最佳工艺条件的验证试验 -10-94264.5用超声波-乙醇提取法提取积雪草苷与乙醇浸渍提取方法的作比较 -10-29766第五章讨论与结论 -12-8110参考文献 -14-第一章前言积雪草为伞形科积雪草属植物积雪草(CentellaasiaticaL.Urban)的干燥全草。根据《中国药典》2015版记载，主治功能有清热利湿，解毒消肿。用于湿热黄疸，中暑腹泻，石淋血淋，痈肿疮毒，跌扑损伤。查阅文献得知积雪草的主要化学成分是三萜皂苷类（积雪草皂苷、羟基积雪草苷）、多炔烯烃类、挥发油类；还含有大量的糖叶绿素、葡萄糖等成分。药理作用：抗癌作用、抗抑郁作用、具有抗菌消炎、促进创伤愈合的作用、增强免疫系统的功能并能提高蟾蜍大脑认知能力中积雪草苷和羟基积雪草苷为积雪草中的主要有效成分，其具有抗氧化、抗菌、抗抑郁、调节免疫等功能，用于治疗顽固性创伤，皮肤结核等皮肤疾病。同时积雪草酸属于五环三萜类化合物，是中药积雪草的重要成分，具有广泛的生物活性，如治疗皮肤创伤和慢性溃疡、肝保护、抗抑郁、防治心脑血管疾病、抗阿尔茨海默病等。近年来根据积雪草的药理作用及其特点，有研究出更多更好的制剂供临床的使用。比如积雪草和芦荟凝胶均能抑制成纤维细胞的增殖，将芦荟凝胶和积雪草总苷作为复方，制备成复方积雪草凝胶膏剂。陈阳等研究复方积雪草凝胶贴剂的透皮特性及其对增生性瘢痕的治疗效果，发现制备的高、中剂量复方积雪草凝胶贴剂有较好的促瘢痕愈合的作用。芦荟凝胶的加入促进了瘢痕愈合。SaowaneeWannasarit等开发了包含木糖苷积雪草提取物和Eudragit®EPO（GR-SD）固体分散体的液体筏形成制剂，增加了胃溃疡的治疗效果。所以对积雪草中有效成分提取工艺的研究是很有必要的。目前积雪草苷的提取方法主要有回流法、超声波法、微波法、酶法等还有最新研究的无溶剂微波萃取（SFME）法，FarhanaNaziraIdris等通过田口方法优化了影响积雪草积雪草苷SFME的工艺参数等。超声波是频率f>20kHz的声波。超声波对植物中药材的提取技术，原理是通过对溶剂中药材的空化作用，使空化气泡在振动中不断膨胀，最后发生崩溃，然后液体就从气泡破裂的某一侧进入药材固体的表面，气泡崩溃时产生的巨大的压力导致药材细胞壁的破碎，加快了溶剂进入细胞速度，其次，超声波的振动作用进一步增加了有效物质的溶出和扩散，大大的提高了提取效率；并且超声波提取技术不对提取物的结构产生影响、活性也保持不变。超声波提取较传统提取方法具有提取速度快、提取率高、提取所需温度低、提取的杂质相对较少、溶剂使用量少、有效成分容易分离和纯化、操作方法简单等特点，各方面带来的效益良多，常用于辅助传统的提取技术，是现代的具备高效率、高速、操作简单、节能等特点的新技术之一，在超声波辅助提取的继续研究和开发上具有广阔的前景，在医药制造业、食品工业等工业化大生产方向应用上都有很大的研究价值和意义。本文就是采用超声波-乙醇提取法对积雪草中的积雪草苷进行提取，即利用传统乙醇溶剂提取法的优势也要发挥超声波法的优点，使二者联合应用提取积雪草苷；以积雪草苷代替积雪草总苷，积雪草苷的提取率为指标，通过运用单因素与正交试验的相结合的研究方法，找到一组提取效率高但是成本相对低的最佳工艺，提高积雪草的利用价值，为积雪草中积雪草苷提取的相关工艺研究及其优化提供参考。由于积雪草具有独特的药理作用和潜在的药理价值，近年来，国内外对天然药物的研究日益渐增，积雪草已经成为研究中的热点。刘明珠[2]等采用超声波提取，选取甲醇溶液用超声波清洗器超声提取银叶菊中的总黄酮。阮俊[3]等在正交试验法下，分别用乙醇和水提取野菊花总黄酮，经过一系列的试验，得出的结果为用乙醇提取所得黄酮提取率高于用水提取所得黄酮提取率。裴凌鹏[4]等在超声波方法的条件下，从葛根中提取总黄酮，再经过一系列的试验，确定了超声波方法提取总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度70%，超声波提取25min，提取次数3次，温度为25℃。程晓荣[5]等在微波的条件下结合单因素试验和正交试验得到了最佳提取工艺，再通过大孔树脂柱纯化提取物，紫外光分光度法测定积雪草总黄酮的含量，最后得出积雪草总黄酮在自由基清除能力试验中表现出很好的清除效果。陈宗保[6]等采用微波辅助提取葛粉总黄酮，并用定量分析测定了提取物中的总黄酮的含量。陈凯云[7]等以吸附及解吸率为指标考察4种型号的树脂，确定纯化大蓟黄酮的最佳树脂，并通过单因素分析考察该树脂分离，纯化大蓟总黄酮的最佳工艺条件，经过一系列的试验得出其具体工艺条件为控制上样浓度为5.2mg/ml\流速0.5ml/min，上样体积为3.5BV，洗脱剂浓度为80%，洗脱剂用量为108BV。从积雪草的发现到现在的研究，对于积雪草中黄酮的提取方法也是越来越多，热水提取法、有机溶剂提取和系统溶剂提取法、碱性烯醇或碱性水提取等方法，假如用这些传统的方法来提取的话，提取到植物黄酮的含量会达不到理想中的效果，因为这些传统的方法大都有着提取等待时间较长、提取浓度低、成本较高、所需的试验空间要求较高、得率低等缺点。由于我们时代的发展和科技的进步，因此这些正在逐渐的被更先进和更有效率的方法所替代，比如超声波萃取法和微波辅助法等。微波提取的过程是通过微波能量产生的电磁波瞬间穿透萃取的物质内部，使细胞内部的温度急速上升，进而使细胞壁膨胀，当产生的压强超过细胞壁所承受的范围，就会达到细胞壁破裂的效果，其目的是使萃取成分能够爆裂流出，溶解在适当的温度下的萃取液中，再通过逐步过滤，抽滤和分离等一系列的提纯方法，才得到目标产物。紫外分光光度法是分光光度法的一种，在紫外光作光源的条件下，对有特征吸收的物质进行定性定量分析，不加显色剂就能直接测定，灵敏度极高，操作简便，准确度高，重复度良好。在微波辅助法下用正交实验和紫外分光光度法提取积雪草中的黄酮类化合物，可以对积雪草中的总黄酮含量进行测定，通过正交试验等一系列的试验确定了最佳提取工艺，选择的最佳工艺对提取积雪草全草总黄酮为最佳，用槲皮素或山奈酚标准品作为对照品，并采用紫外分光光度法进行定量分析，这种操作生产成本低，准确度较高，灵敏度高，重复性好，是积雪草全草中总黄酮含量测定的一种实际的方法[8]。第二章材料2.1材料与试液积雪草药材：购买于广西南宁某药材店铺采摘的新鲜野生积雪草。积雪草苷标准品：成都埃法生物科技有限公司，纯度≧98%。其余试剂均为化学分析纯，均购于天津欧博凯化工有限公司。2.2主要仪器电热恒温鼓风干燥箱（上海喆宣机械制造厂）。数显恒温水浴锅（上海力辰邦西仪器科技有限公司）。高速万能粉碎机FW-100型(北京永光明医疗仪器有限公司)。德森DSA50-JY2超声波清洗机（德森精工有限公司）。德国赛多利斯BSA120型万分之一分析天平（深圳林涛仪器有限公司）。UV-721紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。第三章试验方法3.1样品处理将购买的新鲜的积雪草药材洗净后，放入60℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥30分钟，烘干后用万能粉碎机粉碎，过80目筛，得积雪草粗品备用。3.2试验方法3.2.1对照品溶液的制备精密称取积雪草苷对照品适量，加乙醇溶解并稀释制成每1ml含0.2mg的溶液，即得对照品溶液。3.2.2供试品溶液的制备精密量取积雪草粗品2.00g放入锥形瓶中，在一定浓度的乙醇溶液下，一定的料液比，一定的超声时间条件下提取两次，抽滤得滤液，将滤液合并，将滤液放置在恒温水浴锅浓缩滤液至20ml，放置100ml容量瓶中，加乙醇稀释定容置刻度，即得供试品溶液。3.2.3积雪草总苷标准曲线的制备参考陆兴毅的积雪草总苷标准曲线的绘制方法，进行稍加修改，试验步骤如下：精密量取上述对照品溶液（0.2mg/ml）0.02，0.04，0.06，0.08，0.10mL于10ml试管中，分别标号为1，2，3，4，5，其中取试剂无水乙醇作为空白对照，将所有试管放置在恒温水浴锅中蒸发挥去溶剂，待溶液冷却后，加入硫酸3ml，摇匀，然后放在85℃的水浴锅中继续加热45min，待溶液冷却后，放在冰浴冷却后加入乙醇75ml，搅拌，把试管取出放置到室温温度，继续加乙醇溶液稀释定容至刻度，摇匀后取适量在紫外分光光度测定仪上检测，在276nm波长处测定吸收度，同时做空白试验。以吸光度为A纵坐标，积雪草苷标准溶液浓度c为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。3.2.4积雪草中积雪草苷的含量测定取适量供试品溶液，按照积雪草苷标准曲线下的操作测定样品吸光度A，并根据回归方程计算积雪草苷的提取率。3.2.5积雪草中积雪草苷的提取率计算提取率= 积雪草苷提取液浓度×定容体积×稀释倍数 ×100%积雪草苷粗粉质量 3.3单因素试验3.3.1乙醇浓度的单因素试验称取20mg积雪草粗粉，在料液比1:10mg/mL，超声时间50min，提取温度65℃的条件下进行提取，计算当乙醇体积分数分别为55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%时的吸光度A值，并计算对积雪草中积雪草苷的提取率。3.3.2料液比的单因素试验称取20mg积雪草粗粉，在乙醇浓度为60%，超声时间50min，提取温度65℃的条件下进行提取，计算当料液比分别为1:5，1:10，1:15，1:20，1:30，1:35mg/mL时吸光度A值，并计算对积雪草中积雪草苷的提取率。3.3.3超声时间的单因素试验称取20mg积雪草粗粉，在乙醇浓度为60%，料液比1:10，提取温度65℃的条件下进行提取，计算当超声时间分别为10，20，30，40，50，60，70min时吸光度A值，并计算对积雪草中积雪草苷的提取率。3.3.4提取次数的单因素试验称取20mg积雪草粗粉，在乙醇浓度为60%，料液比1：10，超声时间50min的条件下进行提取，计算当提取次数分别为1，2，3，4，5次时吸光度A值，并计算对积雪草中积雪草苷的提取率。3.4正交试验根据单因素试验结果，以乙醇浓度A、料液比B、超声时间C、提取次数D为影响因素，采用正交试验L9(34)法，考察4个因素对积雪草苷提取率的影响，选取最佳提取工艺条件。正交试验因素水平表见下表3-1。乙醇浓度（%）超声时间（min)料液比(mg/ml）提取次数155301:101265501:152375701:203表3-1

第四章结果与分析4.1积雪草苷标准曲线依照2.2.3下积雪草苷标准曲线的绘制方法，以吸光度为A纵坐标，积雪草苷标准溶液浓度c为横坐标所绘制标准曲线。积雪草苷相应数据如表4-1。试验编号12345浓度（mg/ml）0.20.40.60.81吸光度0.1720.3260.4680.6170.772表4-1求得的回归线方程为A=4.545C+0.0777，r2=0.9998。表明在浓度在0.02-0.1mg/ml范围内的积雪草苷与吸光度有良好的线性关系。4.1.1精密度试验精密量取同一份供试品溶液，根据标准曲线条件下同法操作6次，考察经6次测定后吸光度结果之间的接近程度。结果，RSD=1.53%（n=6），表示仪器的精密度好。4.1.2重复性试验精密称取2mg积雪草药材备用品，根据标准曲线条件下制备供试品6份，分别进行吸光度检测。结果，RSD=1.72%，（n=6），说明该方法的重复性好。4.1.3稳定性试验精密量取同一份供试品溶液适量，根据标准曲线条件下同法操作，测定供试品溶液在10min，20min，30min，40min，50min，60min的吸光度值。结果，RSD=1.63%（n=6），说明该供试品溶液在1h内的稳定性良好。3.1.4加样回收试验取已知被测成分含量为0.10mg/ml的供试品6份，加入精密量取的对照品溶液0.05ml，根据标准曲线条件下同法操作。结果，积雪草苷的平均回收率为100.07%，RSD=1.34%（n=6），说明该方法的回收率好。4.2单因素实验结果分析4.2.1乙醇浓度对积雪草苷提取率的影响由图2可知，随着乙醇浓度的提高，积雪草中积雪草苷的提取率也随之增加，当乙醇浓度达到75%时，提取率最高，随后随着乙醇浓度的增高提取率反而呈现下降趋势。这可能是因为起初随乙醇浓度的增加，根据积雪草苷中含有大量羟基的性质以及与乙醇溶液存在“相似相溶”的原理，使得积雪草苷从药材中溶解出来，含量不断增加；当乙醇浓度≧75%时，提取液里可能有积雪草的苷元和除积雪草苷以外的其他物质，从而影响了积雪草苷的提取。4.2.2超声时间对积雪草苷提取率的影响当超声时间从10min增加到50min时，积雪草苷的提取率都呈现为明显的上升趋势，在超声时间为50min时是提取率的最大值，随着超声取时间的继续增加，提取率呈现平稳的缓慢的略微的下降趋势。可能是因为在超声时间为50min时，提取物已经达到了饱和，继续超声，可能会进一步增加杂质的溶出，从而使提取率下降。也可能是因为超声时间的增加而破坏了积雪草苷化学结构，而导致提取率的下降，还需要进一步进行研究。4.2.3料液比对积雪草苷提取率的影响料液比从1:5增加到1:10，提取率上升，且当料液比为1:10时，提取率已达到最大值，随着料液比的继续增大，提取率已经呈现明显的下降趋势。这可能是因为药材与溶剂的接触表面积已经达到最大，即使再增加增大溶剂用量也不会增加提取效果，反而会起到抑制作用，可能因为溶液量的增加而使稀释了溶液的浓度，提取率就会降低，也会造成溶剂不必要的浪费。4.2.4提取次数对积雪草苷提取率的影响随着提取次数的增加，积雪草苷的提取率表现为先上升后下降趋势，当提取次数达到3次时，提取率达到最高，继续增加提取次数，没有使提取率增加反而呈下降趋势。提取次数的增加一方面可以提高药材有效物质的再次扩散和溶出，但同时杂质的溶出也会增加，而导致提取率的下降。4.3正交试验结果分析分别称取积雪草的粗粉10mg，一共9份，根据表1正交试验设计表设计4因素3水平对积雪草苷提取条件进行工艺优化，试验结果见表2。A、B、C、D分别代表乙醇浓度、料液比、超声时间、提取次数。正交试验结果的方差分析如表4-2。试验组/因素ABCD提取率111110.662212220.752313330.785421230.896522310.799623120.863731320.962832131.137933210.884K12.2032.522.6622.345K22.5582.6882.5322.577K32.9832.5322.5462.818K10.7340.840.8870.782K20.8220.8960.8440.839K30.9770.8440.8490.939R0.2430.0560.0430.157表4-2由表4-2数据对正交试验进行极差分析，4个因素对积雪草苷提取率影响从大到小依次为：A>D>B>C，即乙醇浓度>提取次数>超声时间>料液比，其中影响比较大的是乙醇溶剂的浓度和提取的次数，超声时间和料液比影响相对较小。并且从结果中可以看出，提取的最佳水平组合为A3B2C1D3，即当提取条件为乙醇浓度为75%，超声时间为50min，料液比为1：10，提取次数为3次时，从积雪草中提取得到积雪草苷的提取率最高，A3B2C1D3组合也是正交设计实验中的第8组，提取率也是达到了1.137%。通过对正交试验和单因素试验结果的对比分析，最佳水平组合的结果一致，为了获得最大的提取率，在提取过程中要严格掌控乙醇浓度和提取的次数。4.4正交试验最佳工艺条件的验证试验对正交实验获得的最佳水平组合做验证实验。取积雪草粗粉10mg，按A3B2C1D3组合条件进行3次平行提取实验，结果见表3。计算得到积雪草中积雪草苷的平均提取率为1.249％，并且每一组的提取率都比正交试验得出的最优水平组合的提取率高，说明该最佳水平组合提取条件效果可行的，是最佳的工艺条件。正交实验的最佳水平组合验证实验结果如表4-3。试验次数积雪草质量(mg)积雪草苷提取率（%）平均提取率（%）1101.2331.2492101.2613101.252表4-34.5用超声波-乙醇提取法提取积雪草苷与乙醇浸渍提取方法的作比较取10mg的积雪草粗粉，用超声波-乙醇提取法和乙醇浸渍提取法(乙醇浸渍提取法参照贾广韬的实验方法)，两种实验方法进行比较。实验条件和结果如表4-4。提取方法/提取条件乙醇浓度（%）料液比粉碎粒度（目）提取时间(min)提取次数提取率（%）超声波-乙醇法75%1:108070min31.262乙醇浸渍法70%1:1080120min30.897从表中我们可以看出，用超声波-乙醇法比乙醇浸渍提取法得到积雪草苷提取率大，在料液比，提取次数一样的情况下，乙醇浸渍提取法用的提取所用时间差不多是超声波辅助乙醇提取法的两倍，说明超声波辅助乙醇提取法，在超声波的作用下加速了乙醇溶剂进入药材的速度，提高了药材有效物质的溶解和提取，而传统的乙醇浸渍提取法，也有助于对药材有效物质的提取，但提取时间很长，提取率为0.897％，提取效果没有超声辅助乙醇的提取效果好；而且提取的时间长，消耗的的资源也相对增多。另外，我们也可以看出，相对高一点的乙醇浓度也有助于提高提取率，这可能是因为较高浓度的乙醇与药材提取物细胞之前产生较大的浓度差，进一步促进了药物有效物质的溶出和提取。另外在侯文砚的实验研究中也表明用超声波提取的积雪草苷提取率高于传统的乙醇溶剂回流提取法提取的积雪草苷。综上所述，超声波辅助乙醇的提取效果比传统的乙醇溶剂提取效果好。

第五章讨论与结论积雪草生长普遍，积雪草提取物在药品、化妆品等上都有广泛的应用，如何利用现有的中药提取技术高效地进行药材有效成分的提取成为现在研究的热点。积雪草中苷类化合物：积雪草苷、羟基积雪草苷及它们的同系物积雪草苷B是发挥其药理作用的主要有效成分[18]。目前，有以下几种的苷类化合物提取的方法：乙醇溶剂提取法、超声波提取法、超滤提取法、微波提取法、酶法提取、闪式提取法、高压提取法和超临界CO2萃取法等。在本次使用超声波-乙醇提取法中，从正交实验结果中可以看出乙醇浓度和提取次数成为了影响积雪草苷提取率比较大的影响因素。根据上图积雪草苷的结构特点，乙醇浓度成为影响较大的因素这可能是因为，积雪草苷的结构含有很多的羟基，极性大，根据“相似相溶”的原理，可以知道，当乙醇浓度较低时，水溶性成分含量多，积雪草苷的提取率增加，而当乙醇浓度过高时，溶剂的极性下降，积雪草的提取率反而下降。所以要注意观察和控制好乙醇溶剂的浓度，才有利于提高提取的效果，否则，乙醇浓度过高将会对提取物的溶出产生很大的影响。提取次数成为影响较大的因素可能是因为，随着提取的次数过多，提取出的杂质也会随着增加，提取率就会降低；提取次数多，耗费的资源也多，所以要找到适合的提取次数，在能提取出基本所需的有效物质的情况下，尽量使用较少的提取次数，达到节约资源和成本的要求。根据与传统提取技术作了实验对比以及超声波-乙醇法自身拥有的空化效应、热效应和机械效应等特点来增加有效物质的溶出和提取。另外超声波不需要高温，一般在40摄氏度至50摄氏度水温中进行，有一定杀菌作用。超声波在破坏细胞壁时，具有在加速有效成分溶出同时还不破坏成分活性的优点，与传统酶提法、水提法、传统醇提取工艺相比，超声波能更好地破坏积雪草的细胞壁和细胞膜，促进羟基积雪草苷的流出，有较高的提取率；与索氏回流提取工艺相比，耗时短，耗能低，所用成本较低；与闪式提取法相比，提取效率较高。超声波提取法和乙醇溶剂法联合运用于提取积雪草时，汲取了两者的优点，大大提高了积雪草有效成分的溶出和提取率。所以比其他提取方法更有它的优势，具有节约成本，缩短提取时间和高效率的优点，在走向中药现代化这一领域中，超声波辅助乙醇技术是关键的技术之一，值得广泛的推广和使用。结论：本试验采用单因素试验和正交试验对超声辅助乙醇提取积雪草中积雪草苷条件进行了优化，优化后的最佳提取条件为乙醇浓度为75%，超声时间为50min，料液比为1：10，提取次数为3次，提取率也是达到了1.137%。

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