蛋白质工程PROTEINENGINEERING概述

7.1概述诞生于20世纪80年代初；1983年，美国加州基因公司Ulmer在SCIENCE(VOL.219)上发表以“ProteinEngineering”为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志.2000年6月26日，人类基因组的工作草图宣告完成，标志着生命科学迎来了后基因组时代（post-genomeera）。1蛋白质工程通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋白质的技术，并由此深入研究蛋白质的结构与功能的关系,并使蛋白质更好地造福于人类。——蛋白质工程：侧重于对现有蛋白质的改造——酶工程：侧重于对现有蛋白质的合理利用2基本步骤分离纯化目的蛋白氨基酸测序、X－射线衍射分析、NMR等测试，目的蛋白的结构与功能的分析目的基因的获得及预测改造基因序列（定点突变等）改造后的基因序列进行表达分离纯化表达产物，检测这个步骤实际上是对现有蛋白的改造。3蛋白质工程的方向

基因水平上的蛋白质改造：即在基因水平上改变蛋白质一级结构，以调节蛋白质的二、三、四级结构和功能；DNA合成技术用于蛋白质功能片段多肽基因的合成，可创造结构和功能全新的蛋白质。蛋白质水平上的修饰（即基因翻译后的蛋白质修饰）:对蛋白质分子进行化学修饰和生物修饰，延长蛋白质的稳定性。4研究的核心内容

蛋白质结构分析（X－射线衍射、NMR）

高级结构的预测和分子设计蛋白质的修饰与表达

57.2蛋白质结构分析6蛋白质分子的结构有4个严格的层次，即蛋白质的一级至四级结构。蛋白质的一级结构（primarystructure）是指多肽链的氨基酸残基的排列顺序。线性多肽链在空间折叠成特定的三维空间结构，称为蛋白质的空间结构或构象。蛋白质的空间结构包括：二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构。7蛋白质结构的四个层次一级结构二级结构三级结构四级结构87.3蛋白质结构测定与预测肌红蛋白的三维结构图绿色荧光蛋白（GFP）/newsf/2008-10/2008109173851.htm9一级结构测定基本方法：（1）应用化学裂解法和蛋白酶水解法将多肽链专一性裂解；（2）逐一测定每个纯化的小肽段的顺序；（3）根据肽段氨基酸顺序中的重叠区确定小肽段的排列次序；（4）完成整条多肽链的顺序分析。尽管蛋白质顺序分析已经自动化，但仍然耗时、复杂并且昂贵。重组DNA技术出现后，人们可以从cDNA或基因序列直接推导出蛋白质的氨基酸顺序，速度快且经济，已成为最常用的测定蛋白质一级结构的方法。107.3.1蛋白质三维结构测定11X射线晶体衍射法（X-raycrystallography）和中子衍射法测定晶体中的蛋白质分子构象.核磁共振法（nuclearmagneticresonance，NMR）、园二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法和氢同位素交换法等测定溶液中的蛋白质构象。根据蛋白质的状态，测定蛋白质三维结构的方法分为两大类：aX射线晶体衍射法其研究方法是用X射线轰击待分析的混合物的结晶，并用照相底片将其拍摄下来。这样，就可以得到一张结晶分子的侧视影象照片。通过各种角度的影象照片，就可以建立起一个该混合物分子结构的三维影象。121957年Kendrew用这种方法给出第一张三维蛋白质结构——肌红蛋白的0.6nm的真实图像；1959年Perutz完成血红蛋白0.55nm分辨率的晶体结构；Kendrew（1917-1997），Perutz（1914-2002）。（1962年）13X－射线晶体衍射分析的缺点测定结果可靠，但需分离出足够量的纯蛋白质(几毫克-几十毫克)，制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析。而多数蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶。与溶液中的构象相比，蛋白质分子在晶体中的构象是静态的。所以，利用蛋白质晶体不能测定不稳定的过渡态的构象。蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同，在分析的时候要考虑到这个问题。工作流程较长。X－射线晶体衍射仪14b核磁共振（NMR）不过，最初科学家只能将这种方法用于分析小分子的结构，因为生物大分子非常复杂，分析起来难度很大。科学家在1945年发现磁场中的原子核会吸收一定频率的电磁波，这就是核磁共振现象。由于不同的原子核吸收不同的电磁波，因而通过测定和分析受测物质对电磁波的吸收情况就可以判定它含有哪种原子，原子之间的距离多大，并据此分析出它的三维结构。15瑞士苏黎世瑞士联邦技术学院的库尔特·乌特里希教授:选择生物大分子中的质子(氢原子核)作为测量对象，连续测定所有相邻的两个质子之间的距离和方位，这些数据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图。1983年库特-乌特里希(KurtWuthrich)教授首次运用NMR法解析了胰高血糖素从左至右库特-乌特里希(64岁)、田中耕一(43岁)、约翰-B-芬恩(85岁)（2000年）16NMR法最大的优点:可分析溶液中的肽链的三维结构，进而可对活细胞中的蛋白质进行分析，这意味着可以测得接近生理状态下的样品，也能测出如蛋白质链中极易活动、改变部分的动态的结构。这种方法绕过了结晶、X－射线衍射成像分析等难点，直接分析自然状态下的蛋白质的结构。177.3.2相关数据库多维NMR是目前唯一能够用于测定蛋白质或核酸溶液三维结构的方法，但受分子量的限制。目前，科学家已经利用这一方法绘制出15-20%的已知蛋白质的结构。/pdb/(美国)18蛋白质三维结构数据库(PDB)是国际上唯一的生物大分子结构数据档案库，由美国Brookhaven国家实验室建立。PDB收集的数据主要来源于X光晶体衍射和核磁共振(NMR)的数据，经过整理和确认后存档而成。目前PDB数据库的维护由结构生物信息学研究合作组织(RCSB)负责。使用Rasmol等软件可以在计算机上按PDB文件显示生物大分子的三维结构。/pdb/home/home.do(美国)例如：1HUY(GFP)1920网址：/pdb(美国)21PDB数据库中当前的数据总量PDBContentGrowth

/pdb/statistics/contentGrowthChart.do?content=total&seqid=10022常用的蛋白质一级结构数据库网址：/是UniversalProtein的英文缩写，是信息最丰富、资源最广的蛋白质数据库。它由整合Swiss-Prot、TrEMBL和PIR-PSD三大数据库的数据而成。237.3.3蛋白质结构预测寻找某种蛋白质的空间结构，首先应该查询蛋白质数据库PDB，即查询是否已经有人做过该蛋白质的空间结构测定。HPDB或PDB中只存储至今人们已知其空间结构的蛋白质，数量占生物体中存在的各种蛋白质的很小部分。如果已经拥有蛋白质一级结构序列，无论是由蛋白质测序仪直接测定得到氨基酸序列，或是由基因序列通过遗传密码翻译推测得到氨基酸序列，都可以利用蛋白质结构预测软件（服务）对该蛋白质的三维结构进行预测。每种预测方法都是根据特定的规则进行合理的预测，具有一定的可信度。蛋白质结构与功能的预测

/prediction/prediction.asp24蛋白质结构预测25预测蛋白质结构的方法同源建模——目标序列与模板序列比较，按照模板序列的空间结构，经过优化，产生目标序列三维结构；折叠识别——预测二级结构，预测折叠方式，参考其它蛋白的空间结构，产生目标序列三维结构；从无到有——单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。同源建模方法目前被认为是最精确的方法。相似性大于50％时，结果比较可靠；30～50％之间，其结果需要参考其它蛋白的信息。相似性小于30％时，人们一般采用折叠识别方法。相似性更小时，从无到有法更有效。26同源建模法的步骤从待测蛋白质序列出发，搜索蛋白质结构数据库（如PDB,SWISS-PROT等），得到许多相似序列（同源序列），选定其中一个（或几个）作为待测蛋白质序列的模板；待测蛋白质序列与选定的模板进行再次比对，插入各种可能的空位使两者的保守位置尽量对齐；建模：调整待测蛋白序列中主链各个原子的位置，产生与模板相同或相似的空间结构——待测蛋白质空间结构模型；利用能量最小化原理，使待测蛋白质侧链基团处于能量最小的位置。最后提供给用户的是经过如上四步（或重复其中某几步）后得到的蛋白质三级结构。2728同源建模法预测蛋白质三级结构同源建模比较复杂，Swiss-Model可提供自动化的同源模建分析任务http://www.expasy.ch/swissmod/SM_TOPPAGE.html29本文本框中输入蛋白质序列输入个人邮箱及邮件名称点击提交，即可。7.4蛋白质工程的研究方法30按改动部位的多寡分为三类小改（特定残基的替换）：通过定位突变或化学修饰完成；目前最常用中改（肽段或结构域的替换）：对来源于不同蛋白质的结构域进行组装拼接大改（从头设计）：完全从头设计蛋白质（全新蛋白）31现有蛋白质的改造步骤如下：1、分离纯化需要改造的目的蛋白；2、对目的蛋白进行氨基酸序列分析、X射线晶体衍射分析、核磁共振分析等分析；3、获取编码目的蛋白的基因序列；4、设计改造方案；5、对基因序列进行改造（定点突变（M13、PCR法）等）；6、将改造的基因片段连入合适的载体表达；7、分离、纯化表达产物并对其进行功能检测。32第一个成功的GFP突变体GFP的首个重大改变是钱永健在1995年完成。GFP的单点突变（S65T）显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488nm，而发射峰仍保持在509nm，这和常用的FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力。Heim,R.,Cubitt,A.B.,&TsienR.Y.Improvedgreenfluorescence.Nature.1995Feb23;373(6516):663-4.33改变蛋白质结构的核心技术是基因的人工，目前常用的方法有：M13载体法和PCR扩增法。定点突变M13载体法原理：利用人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物，利用M13噬菌体载体系统合成突变基因。PCR扩增法原理：利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR扩增而获得定点突变的基因。347.5蛋白质工程的应用（一）研究蛋白质结构与功能的关系（二）改变蛋白质的特性（三）生产