第六章 药物安全性检查技术

酸碱滴定分析法第六章药物安全性检查技术公共卫生与护理学院魏友利01热原检查技术无菌和微生物限度检查技术02目录定义热原是指能引起恒温动物和人体体温异常升高的致热物质。广义上包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。药剂中的“热原”通常是指细菌性热原，是微生物产生的代谢产物。热原→吞噬细胞吞噬→白细胞崩解，释放内源性致热原→作用于体温调节中枢→产热增加、散热减少→体温上升家兔法热原检查鲎（hou）试剂法细菌内毒素检查除另有规定外，《中国药典》二部规定了静脉用注射剂均需进行热原或细菌内毒素的检查一热原的家兔检查法由于家兔对热原的反应与人基本相似，家兔法为各国药典规定的检查热原的法定方法。此法是将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。一热原的家兔检查法健康合格，体重1.7~3.0kg，雌兔应无孕，预测体温前七日应用同一饲料喂养病无异常；对未使用过的家兔，或供试品判定为符合规定但组内升温达0.6℃的家兔；或三周内未用过的家兔，均应在实验前3~7日内预检体温，进行挑选；对用过的家兔，如供试品判为符合规定，至少休息48小时。如升温达0.6℃则应休息两周以上；使用次数不超过十次。对家兔的要求一热原的家兔检查法健康合格，体重1.7~3.0kg，雌兔应无孕，预测体温前七日应用同一饲料喂养病无异常；对未使用过的家兔，或供试品判定为符合规定但组内升温达0.6℃的家兔；或三周内未用过的家兔，均应在实验前3~7日内预检体温，进行挑选；对用过的家兔，如供试品判为符合规定，至少休息48小时。如升温达0.6℃则应休息两周以上；使用次数不超过十次。对家兔的要求一热原的家兔检查法准备工作每批供试品初试用3只，复试5只。在检查前1~2日，家兔应处于同一温度环境中，实验室应为17~25℃，与饲养室温度相差不大于3℃，并防止动物躁动和避免噪声干扰。家兔在实验前至少一小时开始停止给食，并置于宽松装置中，直至实验完毕。测温装置精密度应为±0.1℃。一热原的家兔检查法准备工作测温探头或肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于一分半钟，每隔30分钟测量一次，一般测两次，两次体温之差不超过0.2℃，以平均值作为该兔正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在38.0~39.6℃，且同组各兔间正常体温之差不得超过1℃。试验用的注射器、针头及一切和供试品接触的器皿，应置烘箱中250℃加热30min，或180℃加热2h，也可用其他适宜方法除去热原。一热原的家兔检查法检查法测家兔正常体温后15min内，由耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至38℃的供试品溶液，然后每隔30min测体温1次，连续测6次。每只家兔正常体温与注射供试品溶液后6次测量体温中最高的体温之差，即为该兔的升高温度。如3只家兔中有1只体温升高0.6℃或以上，或3只家兔体温升高均低于0.6℃但升高总和达1.4℃或以上，则另取5只家兔复试，方法同上。一热原的家兔检查法结果判定1.判为符合规定：在初试3只家兔中，体温升高均低于0.6℃并且升高总和低于1.3℃在复试5只家兔中，体温升高0.6℃或以上的家兔不超过一只，并且初试与复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或以下一热原的家兔检查法结果判定2.有下列情况者，复试一次：3只家兔1只体温升高0.6℃或以上3只家兔升温均低于0.6℃但升温总和达1.3℃或以上一热原的家兔检查法结果判定3.有下列情况者，判为不符合规定：在初试3只家兔中，体温升高0.6℃或以上的超过一只复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或以上的家兔超过一只在初试与复试合并的8只家兔中体温升高总和超过3.5℃一热原的家兔检查法结果判定4.出现负值的规定如下：当家兔升温为负值时，均以0℃计。一热原的家兔检查法注意事项尽量使用热原测温仪测温，因为其感温探头在整个测温过程中都置于家兔肛门内，所测体温较正确，同时也避免了漏检现象。热原耐热性好，但在180℃3~4h，或200℃60min，或250℃30~45min可彻底破坏热原。因此耐热物品如玻璃制品、注射器等均可用此法破坏热原。热原实验室内外应保持安静，避免日光直射。一热原的家兔检查法注意事项捉拿家兔时，应一只手抓住颈部，一只手托其臀部，避免其挣扎。整个过程中要避免家兔骚动以保持体温恒定。注射时，先用75%酒精棉擦耳朵边缘，再由兔耳静脉缓缓注入规定剂量的供试液。注射完毕用手捏住针眼处，以助止血。试验过程中，要及时填写兔卡和原始记录。家兔法热原检查鲎（hou）试剂法细菌内毒素检查除另有规定外，《中国药典》二部规定了静脉用注射剂均需进行热原或细菌内毒素的检查一细菌内毒素的鲎试剂检查法主要来源主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖，这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约在1~5纳米

。细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为1至100EU/ml。一细菌内毒素的鲎试剂检查法热源=内毒素？

热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。一细菌内毒素的鲎试剂检查法与热源对比内毒素检查法优势方便、快捷、经济；重现性好、灵敏度高；避免抗原的产生，克服生物测定的误差；

近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热原法一细菌内毒素的鲎试剂检查法与热源对比内毒素检查法优势方便、快捷、经济；重现性好、灵敏度高；避免抗原的产生，克服生物测定的误差；

近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热原法一细菌内毒素的鲎试剂检查法在药检中的应用

细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，已经广泛的被世界各国药典收载。成品检查——药品安全性检查之一

半成品（生产过程）检查——事前质控手段，避免造成药品成批报废一细菌内毒素的鲎试剂检查法鲎的图片鲎的长相既像虾又像蟹，人称之为“马蹄蟹”,是一类与三叶虫(现在只有化石)一样古老的动物。鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进行监测。

一细菌内毒素的鲎试剂检查法《中国药典》批准使用方法：供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。本节将着重介绍凝胶法法的操作与有关原理。测定

方法

凝胶法

光度测定法

浊度法

显色基质法

一细菌内毒素的鲎试剂检查法凝胶法基本原理

内毒素（LPS）

激活

凝固蛋白原凝固蛋白（溶解状态）

（凝胶状态）凝固酶原凝固酶一细菌内毒素的鲎试剂检查法凝胶法名词解释—国家标准品及工作标准品国家标准品：（单位：EU/ml）自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价；工作标准品：

经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符复核、干扰试验及各种阳性对照；一细菌内毒素的鲎试剂检查法名词解释—鲎试剂

鲎（hòu）是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。将此物质进行提取，经低温冷冻干燥而成的生物试剂即为鲎试剂，专用于细菌内毒素检测。一细菌内毒素的鲎试剂检查法基本概念1—细菌内毒素限值（L）

指人对药品中细菌内毒素所能耐受的不致引起热原反应的某定量限值（L）；计算公式：L=K/M

K：每公斤体重每小时最大可接受内毒素剂量，注射剂K=5EU//(kg.h)M:每公斤体重每小时的最大供试品剂量；以胸腺素α1计算限值为例：

L=5EU/(kg.h)

÷(1.6mg÷60kg)=185.19EU/mg

药典规定标准：小于10EU/ml一细菌内毒素的鲎试剂检查法基本概念2—确定最大有效稀释倍数（MVD）

指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测；

计算公式：MVD=cL/λL：供试品的细菌内毒素限值

c：供试品溶液的浓度λ：鲎试剂灵敏度

以胸腺素α1计算最大稀释倍数为例：

MVD=10EU/mg×1.6mg/ml÷0.25EU/ml=64（倍）一细菌内毒素的鲎试剂检查法方法步骤

1.鲎试剂灵敏度复核试验3.凝胶适量试验2.干扰实验目的：检查当所使用的鲎试剂灵敏度是否与标示灵敏度有差异，是否影响检验结果目的：检查鲎试剂、供试品配方、检查用的水等试验条件是否影响实验结果目的：检查供试品内毒素是否合格一细菌内毒素的鲎试剂检查法1.鲎试剂灵敏度复核试验（1）根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ共4个浓度的内毒素标准溶液。标示值（λ）：购买的鲎试剂所标示的标示灵敏度。也就是该鲎试剂按照规定方法能检测到样品中内毒素的浓度，单位：EU/ml举例-注射用硫酸链霉素中细菌内毒素的检查一、试剂和样品鲎试剂（批号：040317灵敏度λ：0.25EU/ml；规格均为0.1ml/支；湛江海洋生物制品厂生产）细菌内毒素检查用水（批号：031229规格：2ml/支；湛江海洋生物制品厂生产）细菌内毒素工作标准品（内毒素工作标准品2004-2，160EU/支，中国药品生物制品检定所提供）注射用硫酸链霉素（规格：1.0g/1.0ml

批号：20020523生产厂家：大连美罗大药厂）0.1ml/支规格鲎试剂原安瓿18支

0.1ml内毒素检查用水4支4支4支4支2支2.0λ内毒素溶液1.0λ内毒素溶液0.5λ内毒素溶液0.25λ内毒素溶液内毒素检查用水0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml内毒素工作标准品或国家标准品内毒素检查用水溶解15min稀释37±1℃保温1h呈阳性呈阴性

复溶细菌内毒素检查法——凝胶法试验结果（阴、阳性）判定：0.1ml/支规格鲎试剂原安瓿18支

0.1ml内毒素检查用水4支4支4支4支2支2.0λ内毒素溶液1.0λ内毒素溶液0.5λ内毒素溶液0.25λ内毒素溶液内毒素检查用水0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml内毒素工作标准品或国家标准品内毒素检查用水溶解15min稀释37±1℃保温1h呈阳性呈阴性结果有效计算鲎试剂灵敏度

式中：X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ～2.0λ时，方可用于内毒素检查，并以λC为该批鲎试剂灵敏度复溶举例-注射用硫酸链霉素中细菌内毒素的检查2.0λ内毒素溶液1.0λ内毒素溶液0.5λ内毒素溶液0.25λ内毒素溶液内毒素检查用水+++++++－++－－

－－－－－－－－阳性λc=0.354EU/ml二细菌内毒素的鲎试剂检查法方法步骤

1.鲎试剂灵敏度复核试验3.凝胶适量试验2.干扰实验目的：检查当所使用的鲎试剂灵敏度是否与标示灵敏度有差异，是否影响检验结果目的：检查供试品配方、检查用的水等试验条件是否影响实验结果目的：检查供试品内毒素是否合格二细菌内毒素的鲎试剂检查法2.干扰实验编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液———2B2λ/供试品溶液供试品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/检查用水检查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D无/检查用水———2举例-注射用硫酸链霉素中细菌内毒素的检查根据《临床用药须知》和《化学药品说明书汇编》表明：人体每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量为：5.0EU；硫酸链霉素在人均体重60kg，注射时间1小时最大供试品剂量为1.2g；细菌内毒素限值：L=K÷M=5.0EU/(kg·h)÷1200mg/(60kg·h)=0.25EU/mg举例-注射用硫酸链霉素中细菌内毒素的检查确定最大有效稀释倍数(MVD)：MVD=CLλ=1000mg/ml×0.25EU/mg0.25EU/mg=1000倍二细菌内毒素的鲎试剂检查法2.干扰实验按表制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。二细菌内毒素的鲎试剂检查法2.干扰实验编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液———2B2λ/供试品溶液供试品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/检查用水检查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D无/检查用水———2二细菌内毒素的鲎试剂检查法2.干扰实验前提：A和D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下列计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。

Es=lg-1（ΣXs/4)

Et=lg-1（ΣXt/4)式中

Es、Et分别为系列溶液C和溶液B反应终点浓度的对数值(lg)。二细菌内毒素的鲎试剂检查法2.干扰实验当Es在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ）及0.5Es~2Es（包括0.5Es和2Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。二细菌内毒素的鲎试剂检查法方法步骤

1.鲎试剂灵敏度复核试验3.凝胶适量试验2.干扰实验目的：检查当所使用的鲎试剂灵敏度是否与标示灵敏度有差异，是否影响检验结果目的：检查供试品配方、检查用的水等试验条件是否影响实验结果目的：检查供试品内毒素是否合格二细菌内毒素的鲎试剂检查法3.凝胶适量试验编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2B2λ/供试品溶液2C2λ/检查用水2D无/检查用水2二细菌内毒素的鲎试剂检查法3.凝胶适量试验结果的判断及处理：1.若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照B的平行管均为阳性，阴性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效；二细菌内毒素的鲎试剂检查法3.凝胶适量试验结果判定