家族性肥厚型心肌病的家系基因及临床表型研究

家族性肥厚型心肌病的家系基因及临床表型研究

肥厚心肌病（hcm）是最常见的遗传疾病，属于正常染色体和显性遗传。是一种原发于心肌的疾病,临床常表现为心室肌肥厚,尤其是室间隔非对称性肥厚,心律失常,运动耐量受损及猝死。猝死原因主要是心室颤动。目前发现引起HCM的致病基因有β-肌球蛋白重链(MYH7或β-MHC)、肌球蛋白连接蛋白C(MYBPC3)和肌钙蛋白(TNI)等12个致病基因,分子遗传学检查对HCM的早期诊断和治疗有重要意义。因此,我们对收集的10个家族性肥厚型心肌病家系筛查了HCM前3位致病基因即MYH7、MYBPC3和TNNT2基因,以了解中国汉族家族性肥厚型心肌病的发病基因及突变特点。病例对照及检测1.对象:10个汉族家族性肥厚型心肌病的家系,分别来自黑龙江、河南、河北、北京、湖南、安徽及浙江。10例先证者男5例,女5例,年龄1.5~73岁。患者均经二维及多普勒超声心动图、心电图诊断为HCM,家族性肥厚型心肌病的患者其家族中至少两人发病。临床资料包括体检、心电图、二维及多普勒超声心动图检查。HCM患者诊断标准:超声心动图检查室间隔或心室壁厚度≥13mm,排除高血压、主动脉瓣狭窄等其他可能引起心肌肥厚的心血管疾病和全身疾病(诊断依据WHO/ISFC1996年公布标准)。对照为80例健康志愿者[均为汉族,男47例,女33例,年龄20~71(56.2±14.1)岁],各项检查均未见异常。2.基因组DNA提取:取外周静脉血,EDTA抗凝,盐析法从白细胞中提取患者、家系成员及正常对照组的基因组DNA。3.聚合酶链反应(PCR)扩增家族性肥厚型心肌病先证者相关基因外显子含侧翼内含子序列:据文献报道设计MYH7的3~27及40外显子含侧翼内含子序列的引物和哈佛医学院网站提供的MYBPC的2~35外显子含侧翼内含子序列的引物,TNNT2的2~16外显子含侧翼内含子序列的引物,由北京奥科生物技术有限公司合成引物。PCR扩增体系40μl,反应体系含基因组DNA250ng,双向引物9pmol,dNTP160μmol,10×buffer4μl,TaqDNA聚合酶2U(鼎国生物技术公司)。扩增条件:1.预变性,95℃5min;2.变性,95℃30s;3.退火62℃30s;4.延伸,72℃40s;5:重复2~4步骤,共35个循环;6:延伸72℃,10min。PCR仪为美国MJResearch公司的PTC-200。4.PCR产物测序并分析:将所扩增的外显子的PCR产物均按双脱氧末端终止法进行测序反应(美国ABI公司3730XL测序仪),测序引物与PCR引物相同。5.应用先证者发生突变的外显子的扩增引物序列,扩增家系中其他成员和80例正常人的相关基因片段,PCR产物按双脱氧末端终止法进行测序反应。6.突变位点的确定:应用VectorNTI7.0分析软件分析测序结果。并与GenBank中的标准序列进行比对。确定可能的突变位点。与GenBank中收集的突变进行比对确定新发现的突变点。家系病例对照调查1.10个肥厚型心肌病家系中共有91例成员,其中5例健康携带者,23例患者(男14例,女9例,年龄1.5~73岁),患者中4例发生猝死。10个家系中5个家系发现基因突变。5个突变家系先证者临床资料及突变点见表1。5个突变家系系谱图见图1。H18家系中,2人患病,先证者之父H18-Ⅰ-1,48岁时,在剧烈运动后发生猝死,其弟H18-Ⅱ-5为健康携带者,临床表现正常,超声也无异常。家系H9先证者之父H9-Ⅱ-8,25岁时猝死,其姑母H9-Ⅱ-1于20岁时猝死。家族中12人患病,除猝死的2人无超声检查资料外,其他10人超声检查各有不同,有的为梗阻性(H9-Ⅲ-10),有的为非梗阻性(H9-Ⅱ-6),有的以室间隔增厚为主,有的弥漫性左室壁增厚。家系H21先证者除心肌肥厚外左心明显扩大,心功能减低,射血分数40.3%。H23家系患者大多发病晚,38~49岁,症状轻,病情进展缓慢。先证者之兄H23-Ⅱ-2,75岁,49岁时发病,当时查超声室间隔增厚为30mm,左室40mm,左房30mm,右室20mm,并提示有左室流出道轻度狭窄。25年后复查心脏超声:左室42.3mm,左房43.8mm,室间隔厚度25.4mm,左室后壁厚度10.8mm,未见明显左室流出道狭窄。射血分数66%。但先证者之弟H23-Ⅱ-10,曾诊断为HCM,在44岁时发生猝死。H13家系患者发病较早,6~10岁。2.基因筛查结果:(1)β-MHC基因突变分析(图2):在3个家系中分别发现3个致病突变。家系H18先证者为18外显子发生G12601A突变,导致氨基酸改变,即Arg663His。家系H9先证者为23外显子发生G15373A突变,导致氨基酸改变,即Glu924Lys。家系H21先证者在20外显子发生T13659C突变,导致氨基酸改变,即Ile736Thr。家系H18中健在的其他人员除先证者之弟H18-Ⅱ-5携带该突变外,余未见相同突变。家系H9中所有临床诊断HCM的患者均在23外显子的同一位点发生相同突变,而H9家系中正常人均未发现该位点突变。H21家系其他2例患者H21-Ⅲ-3和H21-Ⅲ-5均发现Ile736Thr,H21-Ⅳ-2也发现该突变,但无临床不适主诉,心电图无异常,心脏超声正常(室间隔8mm,左室后壁7mm,左房26mm,左室45mm)。在80例对照中,均未发现Arg663His、Glu924Lys及Ile736Thr突变。(2)MYBPC基因突变分析(图3、4):H23家系的先证者中,发现13外显子存在5碱基插入突变,即在7425~7426间插入CGGCA,使该基因发生Gly347fs移码突变。H23家系中另一患者H23-Ⅱ-2也发现相同突变,H23-Ⅲ-1(43岁)、H23-Ⅲ-3(38岁)、H23-Ⅳ-1(14岁)亦携带相同突变,但临床表现正常。而家系中其他正常人未发现该突变。在H13家系的先证者中,发现MYBPC3基因的18外显子,发生C10951T突变,导致氨基酸改变即Arg502Trp,家系中另一患者即先证者之母测序结果发现相同突变,而先证者之父未发现该突变,其临床表现亦正常。在80例对照中,均未发现Gly347fs移码突变及Arg502Trp突变。(3)TNNT2基因筛查结果:10个家系均未发现TNNT2基因外显子突变。但在3号内含子中发现一个短片段重复序列(STR)多态性即CTTCT5个碱基的重复序列多态性。H14家系先证者中插入/插入型,H34先证者为插入/缺失型,其余家系先证者为缺失/缺失型(图5)。glu624lys突变HCM是一种常染色体显性遗传病。特征为左室壁肥厚,没有其他可引起心肌肥厚的因素,是一种原发于心肌的疾病。一般人群发病率0.23%。HCM有猝死的危险性,猝死原因主要是心室颤动。在美国HCM是运动相关性猝死的最常见的原因。常发生于平素健康的年轻人(包括运动员)。本资料23例患者中4例发生猝死,猝死率为17%。猝死是HCM最显著及最严重的后果。其猝死的发生率尚不清楚。对于有猝死危险因素的患者,心脏植入埋藏心脏除颤器(ICD)应作为一级预防治疗。因此,临床上及时发现高危患者具有重要意义。引起HCM的致病基因主要为MYH7、MYBPC3和TNNT2三个致病基因,占目前所发现的12个致病基因的60%~80%。β-肌球蛋白重链基因突变所致的HCM约占病例总数的30%~50%。我国有关HCM的β-MHC基因突变的报道包括3,13,18,19外显子,尚未发现20外显子突变,本研究首次发现我国北方汉族家族性肥厚型心肌病的β-MHC基因20外显子突变——Ile736Thr。突变家系的外显率高,仅H21-Ⅳ-2尚未外显,其年龄13岁,而一般认为HCM的表现型具有年龄依赖性,多数青少年以后发病,其临床表型有待随访观察。本家系中患者症状出现较晚(如H21-Ⅲ-3、H21-Ⅲ-5),但病情进展较快,数年内即发生了心脏扩大,心力衰竭(H21-Ⅱ-1),预后较差,同一家系中表现型不完全相同,反映了HCM的发病除与致病基因有关,还与修饰基因和环境因素有关。Arg663His突变国内曾有报道,认为此位点可能为我国汉族人群的多发位点,且预后较好,外显率较低。而本研究发现该突变点也可引起猝死(H18-Ⅰ-1)。Glu924Lys突变则是在我国人群首次发现,H9资料表明,该位点在这一家系外显性高(100%),发病早(H9中Ⅳ-1发病年龄6岁,Ⅲ-10发病年龄16岁),预后差(H9-Ⅱ-1和H9-Ⅱ-8分别在20岁和25岁发生猝死,H9-Ⅱ-2在52岁出现重度心力衰竭、房颤及卒中)。Glu924Lys突变最早由美国哈佛医学院报道,为一散发病例,其父母基因学筛查均阴性,但其突变可向后代传递,并且其与子代临床表现迥异。而2003年瑞典报道的Glu924Lys突变则是一个HCM家系。肌球蛋白有3个功能区,即头、颈和尾(或杆)。肌球蛋白头部有一个三磷酸腺苷结合袋(ATPCleft)和一个肌动蛋白结合点。肌球蛋白通过颈部的伸展与肌动蛋白发生作用,其尾部用来固定分子。大多数β-肌球蛋白突变表现为疾病外显率高并且猝死率高,本组患者β-MHC基因突变的家系(H9、H18和H21)外显率50%,有2例猝死。Arg663His位于头颈部的肌动蛋白连接区。Glu924Lys则位于杆部,这一部位与MYBPC(肌球连接蛋白-C)相连接,突变导致连接的稳固性减低,影响了β-MHC与MYBPC的相互作用。Ile736Thr位于非保守区。3个突变Arg663His、Glu924Lys及Ile736Thr均位于β-MHC的功能区,可能导致β-肌球蛋白功能改变,但需要下一步功能研究进一步证实。肌球连接蛋白C基因(MYBPC3)突变占患者总数20%~30%,Gly347fs移码突变是在我国HCM患者中首次发现,国外也尚未见报告(/project3)。家系H23资料表明,该位点突变在这一家系中的特点为发病晚(先证者发病时38岁,先证者之兄发病时49岁;而H23-Ⅲ-1,Ⅲ-3均在40岁左右还未发病),与国外报道MYBPC3基因发病普遍较晚相一致;该突变家系外显率较高(先证者兄弟姐妹7人,4人诊断为HCM),与HCM的常染色体显性遗传模式符合;家系中虽然携带相同突变,但临床表现也各不相同(H23-Ⅱ-2,室间隔增厚为25.4mm,明显伴左房大;H23-Ⅱ-3室间隔轻度增厚为13.6mm,但左室明显增大,疾病进展缓慢,先证者及先证者之兄在发病后几十年自觉症状无显著加重);但个别患者预后差(H23-Ⅱ-1044岁时发生猝死),显示了临床表型的异质性。H13家系中发现MYBPC3基因的18外显子,发生C10951T突变,导致氨基酸改变即Arg502Trp。H13为一核心家系,母子2人患病,携带同一突变,该家系发病较早,与以往报道不一致,发病机制有待进一步研究。本研究未发现TNNT2基因的功能区密码子的错义突变、小片段缺失、信号剪接部位突变。但在3号内含子发现一个短片段重复序列多态性即CTTCT5个碱基的插入/缺失多态,在我国HCM患者中的D等位基因的比率有偏高趋势。日本的一项研究显示非高血压的心肌肥厚人群的D等位基因频率66.9%,正常对照的D等位基因频率52.5%,二者具有显著差异性(P=0.0009);心肌肥厚人群中缺失/缺失型分布约为47.0%,正常人群的缺失/缺失型分布约为27.2%;心肌肥厚人群中缺失/缺失型的室间隔厚度明显高于其他基因型(插入/插入型,插入/缺失型),P<0.0001。而我国尚无这方面的研究报道。与Song等2005年1月报道的我国HCM患者的TNNT2基因突变较少相一致,该文在51例先证者和49例散发患者中,筛查到1例先证为TNNT2基因突变,我国的家族性HCM的TNNT2基因突变所占比率为2%,远低于国外报道的比率。提示HCM的致病基因分布在不同种族可以明显不同。同其他常染色体显性遗传性疾病类似,家族性肥厚型心肌病的基因型和临床表型间存在高度变异性,没有突变特异性基因表型。这受许多因素干扰,如家族少、家族中出现特定突变的人数少、同一家族中或同一致病基因的家族之间阳性个体