副溶血弧菌病及其疫苗研究进展

副溶血弧菌病及其疫苗研究进展

弧菌病是一种常见的、严重的疾病。为了解决虾类疾病的全球问题，全世界的研究人员进行了大量工作。几种弧菌相继发现，其细菌学特征、发病率和病理学也得到了广泛而深入的研究。作为当前的研究热点，免疫预防和虾皮炎的免疫机制也进行了大量研究。本文将对弧菌病的病原、病理、诊断、对虾的免疫机制及免疫预防等方面的研究进展及趋势作一回顾。1血淋巴微红色弧菌有许多致病种类和菌株,其毒性也因种的不同而差异较大,它们可引发诸如烂眼病、烂尾病、烂鳃病、甲壳溃疡病、肌肉白浊病、黄鳃、红腿病、幼体荧光病和细菌性败血病等多种病症。患弧菌病的对虾的症状是沿塘边游荡,对外界反应迟钝,摄食率下降或停止摄食,中肠内无食物或者充满脓状物质,肝胰腺肿大,血淋巴不易凝固,其颜色也由正常的淡蓝色变为微红色。自Vanderzant等首次从患病对虾体内分离到副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus,研究工作者陆续分离出溶藻弧菌V.alginolyticus,鳗弧菌V.anguillarum,藻弧菌V.algosus,河流弧菌V.fluvialis,坎氏弧菌V.campbelli,海涌弧菌V.nereis,弗氏弧菌V.furnissii,哈维氏弧菌V.harveyi,创伤弧菌V.vulnificus,亮弧菌V.splendidus,美人鱼弧菌V.damsela,非01群弧菌V.choleraenon-01,海弧菌V.pelagius,塔氏弧菌V.tubiashii,杀对虾弧菌V.penaeicida及产气弧菌V.gazogenes等[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13],部分常见弧菌病的症状及其病原的细菌学特征分别见表1,2。续表12虾体弧菌病的发病机制为控制弧菌病的暴发,开展了大量流行病学的调查。调查发现,弧菌病的分布区域几乎为世界性的,其发生没有宿主虾的种属选择性和地理上的差异,也无具体的季节和时间上的区分,在一年四季以及育苗、养成和亲虾的越冬等各个阶段都有发生,夏秋2季为多发季节,其流行适宜温度为25—32℃,尤其在28℃以上时流行极为迅速,几天之内即可造成养殖对虾的大量死亡。除烂眼病主要在低盐度的水域中暴发外,弧菌病多在高盐度的水体中流行。同时,弧菌病的暴发还与虾体的机能状态有着重要关系。如虾的种质条件较差(因近亲繁殖等),在养殖过程中,因过量投饵和对虾的排泄物引起底质极端恶化,从而使水体中的氨氮、硫化氢含量显著升高,养殖水体溶氧显著下降,在恶劣的气候条件如夏季闷热无风或突降暴雨,引起盐度和pH值的急剧变化,以及虾体受到其他疾病如病毒、真菌、寄生虫或立克次氏体的感染等条件下,极易引起虾体的机能下降,病原弧菌乘机大量侵入虾体,从而引起弧菌病的暴发。续表2此外,研究工作者对虾的养殖水体、底泥中弧菌的数量及温度、溶氧等环境因子对弧菌的影响也进行了大量的研究。对弧菌的可能传播途径和感染模式也进行了许多探索,尤其对经喂饲感染、浸浴感染等方式做了大量的工作,这为对虾弧菌病的防治研究提供了重要依据。3常用检测技术病原在感染的早期阶段甚至在携带病原菌期间应被准确的诊断,因为在疾病的控制中正确的诊断最为关键。目前对虾类疾病的诊断方法主要有:外观症状的观察、光镜下直接镜检、组织病理学、电子显微镜超微切片、传统微生物方法(病原菌分离、培养、形态及生化鉴定)、活体鉴定、血清学方法、免疫学和分子生物学诊断(如DNA探针和PCR技术)等。早期的研究工作者采用活体组织或幼体直接压片,在光镜下观察病原体的情况,由于人医、兽医和鱼类诊断新技术的渗透,目前对细菌病的免疫快速诊断技术已被大量应用,这些技术的应用使检测灵敏度不断提高。单克隆抗体技术的应用使检测技术出现了极大的飞跃,由于它快速、简单、灵敏度高、费用低廉,单克隆抗体技术已成为常规诊断中一个非常有用的工具。近年来,随着分子生物学技术的发展,用核酸探针进行的核酸分子杂交技术和PCR技术相继用于对虾细菌性疾病的诊断。总血细胞计数和血淋巴凝固时间也用于虾病的诊断中。但目前虾病的诊断仍然以传统方法为主,几乎每个虾病病理诊断实验室都配备有光镜、组织学以及细菌学方法。4虾壳外产物的致病性早期对虾弧菌的致病性研究主要是用分离菌进行各种感染方式导致发病来判定其致病力,近年来人们开始致力于对疾病的发生、发展等感染过程的研究。通过对弧菌胞外产物(ECP)的分析研究,人们发现弧菌的胞外产物如脂酶、蛋白酶、磷酸脂酶、溶血素和几丁质酶等在弧菌的致病过程中起重要作用,胞外产物的致病机理主要是通过产生蛋白酶或者促使机体组织释放出蛋白酶而造成组织溶解。不同种类的对虾对胞外产物的毒性有较大差别,细菌的毒性和对虾的易感性都是对虾致死的重要因子。应用分子生物学和电镜方法,许多研究者对病原弧菌的侵袭途径、粘附方式、对各器官的粘附强度、粘附受体进行了研究,这为研究弧菌病的致病机理打下了基础。5虾组织病理学特性通过对患病对虾血细胞的病理学研究发现,患病对虾体内抽取的血淋巴凝固时间较长,且有轻微浑浊,血细胞数量明显减少,血清溶菌活力及抗菌活力大大下降。组织病理学和超微病理研究显示,弧菌常导致对虾淋巴器官、鳃、心脏、肝胰腺及其它组织的坏死和炎症,尤以淋巴器官和肝胰腺最为严重。患病对虾的表皮变得不规则并有不同程度的坏死,同时血细胞渗入坏死表皮部位,包围入侵的病原菌,并形成不同程度的黑色结节。肝胰腺变为微红色,细胞器肿胀甚至破裂,溶酶体增多,细胞空泡化,甚至萎缩、坏死,在肝胰腺及中肠肠腔中可见到大量坏死的肝胰腺细胞,肝胰腺管纤维样变,间质组织水肿,血细胞大量浸润,包围入侵细菌,形成肉芽肿。心肌纤维中有少量肥大血细胞,心脏和肝胰腺外周间质组织内常有浓染血细胞和巨噬细胞聚集,其内含有细菌。次级鳃丝肿胀,浓染颗粒和非正常血细胞增多。Y器官中有大量细菌寄生,细胞索上皮细胞透明样变,索和间质组织中有不同程度的血细胞浸润,最后单个细胞索萎缩、坏死,嗜碱性细胞增多,有的形成肉芽肿,其内含有致病弧菌。6大量用药存在盲目性目前,控制对虾弧菌病的主要手段是使用抗菌药物治疗,但药物本身具有许多毒副作用,主要造成对虾生理障碍、药物残留以及药物引起的营养缺乏症等。在长期的药物治疗中,人们认识到药物还存在以下不足:很多疾病尚无有效药物;病因复杂,大量用药存在盲目性;有些化学药品有效面窄,预防作用弱;病虾往往因厌食而难以摄取到有效的药物剂量;食用和接触过多种药物的虾体由于过多积累某些有毒性的药品又可能转害于人体;大量使用药物使养殖成本提高;容易带来环境污染,并导致耐药性微生物大量出现;同时,长期在药物“保护作用”下使大量本应被自然淘汰的抗病力弱的个体存活下来且在群体中所占比例逐渐增大而导致整个群体的抗病能力下降。鉴于使用抗生素等药物有许多安全方面的顾虑,兼之药物不能有效地解决虾病防治问题,因此有效地提高对虾本身的抗病力,是解决问题的根本途径,这促使各国的虾病研究者对虾类免疫学发生了浓厚的兴趣,应用免疫学技术预防虾病已受到越来越多的重视。6.1身的免疫机制对虾的免疫预防,最根本是真正了解虾体本身的免疫机制。同其它无脊椎动物相似,对虾的免疫系统主要由非特异性免疫组成,其中血细胞和一些血清因子起着重要的作用。6.1.1虾类红细胞的分离纯化在虾类的防御系统中,血细胞起着主要作用,包括吞噬作用、包囊作用、形成肉芽肿、细胞毒作用、凝血作用、产生抗微生物物质以及合成和释放酚氧化酶原(proPO)系统等。目前,对虾血细胞命名还没有统一标准,一般根据有无含颗粒或含颗粒多少,分为透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞。透明细胞的核质比例较高,内有蛋白质凝固因子,在异物入侵时,开始凝血,形成凝固的血细胞循环区,细菌等异物同颗粒细胞一起被传送到邻近的凝血区,从而增加被吞噬的机会;小颗粒细胞因含有较多溶菌酶而具有较强的吞噬作用;大颗粒细胞主要起包囊作用,内有酚氧化酶原系统,酚氧化酶原系统的释放被认为是非己识别和吞噬作用的起始。由于对虾血细胞在防御疾病中起着极其重要的作用,因此尽可能了解关于对虾造血组织和造血干细胞等方面的信息,将为对虾类血细胞的研究打下基础。一些科研工作者开始致力于该方面的研究,并对造血组织的部位、类型和造血干细胞的种类有了初步的认识。6.1.2清除细胞内含有大量溶酶体除血细胞外,一些固定性吞噬细胞在异物入侵的过程中起重要作用,它们主要集中在虾体的一些特定部位,对入侵的细菌等异物进行吞噬作用,借助于细胞内含有的大量溶酶体将异物清除。目前,有关固定性吞噬细胞的具体存在部位尚不清楚。Frontaine等认为在白虾Penaeussetiferus中这些固定性吞噬细胞主要集中在鳃、肝胰腺及肠道;Merrill等在对淡水螯虾的研究中发现它们主要存在于心、鳃,肝胰腺中则很少;而Martin等在对单肢虾Sicyoniaingentis的研究中指出,鳃部才是固定性吞噬细胞存在的唯一器官。6.1.3酚氧化酶原系统激活在体液免疫方面,主要是通过一系列的血清因子组成一个复杂的防御网络以达到消除入侵异物的目的。一般认为凝集素、杀菌物质及一些调理因子等血清因子在其中起重要作用。酚氧化酶原系统从现有证据来看,酚氧化酶原系统可能在甲壳动物中起识别和防御作用。酚氧化酶原系统是由丝氨酸蛋白酶和其它因子组成的一个复杂的酶级联反应系统,以非活化状态存在于血细胞的颗粒中,该系统可以被β-1,3-葡聚糖、脂多糖、肽聚糖、胰蛋白、十二烷基硫酸钠(SDS)、加热或Ca2+浓度下降所活化,也能被胰蛋白酶抑制剂、枯草菌素蛋白酶抑制剂和α2-巨球蛋白所抑制,从而避免酚氧化酶原系统自发激活,保护宿主。当细菌等异物入侵时,虾体小颗粒细胞接受革兰氏阴性菌细胞壁上的脂多糖或真菌细胞壁上β-1,3-葡聚糖的信号,进行脱颗粒,并趋向入侵部位进行吞噬。血清中的β-1,3-葡聚糖结合蛋白(BGBP)通过与β-1,3-葡聚糖结合,与颗粒细胞的表面连接,产生胞吐作用,即进行部分脱颗粒释放出丝氨酸,激活酚氧化酶级联系统,使酚氧化酶原系统激活成为有活性的酚氧化酶,该酶粘附到异物的表面起识别和调理作用。具有活性的酚氧化酶可诱导产生黑色素,黑色素及中间代谢产物醌可抑制病原体胞外蛋白和几丁质酶的活性从而杀死微生物和寄生虫。伴随着氧化酶系统的激活,一种76KD的蛋白因子被释放出来,该蛋白质又与邻近的大颗粒细胞和小颗粒细胞相互作用并诱导它们进一步脱颗粒,并将酚氧化酶等产物释放到周围介质中,由此连锁反应放大了对外界因素的细胞应答。在此过程中,可产生大量活性物质,它们通过多种方式参与宿主防御反应,包括提供调理素,促进血细胞吞噬作用、包囊作用和结节的形成,介导凝集和凝固,产生杀菌物质等。凝集素从不同的对虾体内分离提纯到多种凝集素,并显示出对细菌的凝集特性和细胞毒作用。目前,对于凝集素的生理作用还未完全查清,可能在病原入侵时起识别和防御作用,也可能作为受体直接结合到异物的表面,起调理素作用。凝血因子和信息传递因子血浆和血细胞中存在着一些凝血因子,在外来微生物入侵虾体时,促进凝血。此外,血清中一些蛋白质因子如76KD蛋白和BGBP-L还直接参与细胞间的信息传递,通过一系列反应使原始信号得到放大,使宿主能有效地调动免疫系统对抗异物的入侵。6.1.4基于-1,3-葡聚糖的真菌抗御机制对虾虽然有严密的防御网络,有时仍不免受到病原的攻击而死亡,说明病原有其独特的抗宿主防御机制,这迫使人们开始重视病原与宿主对虾之间关系的研究。在真菌对螯虾入侵过程中,某些真菌能够暂时隐藏其细胞壁上的β-1,3-葡聚糖,以逃避宿主的识别和防御。在对虾弧菌病的研究中,该种抗防御机制也得到了研究。Ratanapo等在观察斑节对虾对创伤弧菌的凝聚过程时发现,血清中凝集素在细菌生长的早期能够凝集细菌,以后则失去凝集作用,认为细菌在生长过程中表面可能有一动态变化,细菌只在其生长的早期阶段内(6—9h)能被凝集素所凝集,以后则不被凝集,推测这可能是细菌逃脱对虾防御的一种机制。6.2多维研究有效总成效对虾弧菌病免疫预防的研究刚刚起步,国内外许多研究者作了大量研究,并取得成效[41,42,43,44,45,46,47]。其研究内容主要为疫苗的使用和一些免疫刺激物的应用。6.2.1含灭活弧菌苗的免疫可持续活性全细胞疫苗主要包括弱毒疫苗、福尔马林灭活疫苗和热灭活疫苗等3种,主要接种方式有注射、浸泡、喷雾和喂饲等。在实验条件和实际生产中,全细胞疫苗已得到了较好的预防效果。Lewis等将对虾幼体从高渗溶液中转入含灭活弧菌苗的水体中,1—2d后引起免疫反应,其免疫力可持续到成虾收获。Itami等对细菌病的免疫预防进行了较深入的研究,对口服、浸泡、注射、喷雾等方式接种弧菌疫苗的效果、免疫浓度和疫苗的持久性作了探讨,认为上述免疫方式均能提高对虾的免疫力,且免疫力能持续50d左右。Latchford等通过实验室和小规模生产的试验发现,福尔马林灭活疫苗和弱毒疫苗均能显著增强对虾的抗感染能力。叶孝经和陈水土等分别对弧菌疫苗在中国对虾和长毛对虾中的防治作了探索,认为接种弧菌苗可预防疾病的发生,提高养殖对虾的成活率。6.2.2虾的免疫作用由于对虾的免疫机制还未查清,一些免疫刺激物包括细菌细胞壁碎片、β-1,3-葡聚糖、多肽和其它一些合成产物如免疫多糖或昆虫多糖也被用于对虾的免疫预防,这些多糖类免疫刺激物如脂多糖、葡聚糖等具有激活酚氧化酶系统的作用,提高血细胞吞噬活性及消化和杀死外来入侵微生物的能力,从而提高虾体的免疫力。为了对免疫效果进行定量检测,一些科研人员对疫苗及其活性物质的作用机理也进行了探讨。Adams通过施用热灭活弧菌苗,在对虾的血淋巴中检测到杀菌素和其它一些体液因子,并且发现杀菌素能在血淋巴中保持到第五天。Sung等用间接荧光抗体技术对热杀死的创伤弧菌抗原在对虾体内组织定位进行了观察,发现弧菌苗主要分布在肝胰腺、肠道和淋巴组织中,指出全身性的免疫系统能被增强,但只是一个短期效应。王雷等通过口服几种免疫型药物后,对中国对虾血淋巴中的一些血清因子及酚氧化酶的活性进行了测定,认为这些免疫型药物能激活对虾的免疫系统,增强对疾病的抵抗力。7关于虾类免疫特性的研究目前,对虾弧菌病的致病机理和发病条件还未查清,关于