植物多糖的提取与提取

植物多糖的提取与提取

1日本多糖研究现状除了蛋白质和养分外，茶多酚也是一个重要的生物因素。虽然糖的研究并不比蛋白质和核酸晚，但其研究水平和程度远低于蛋白质和核酸。20世纪70年代以来,随着免疫物质、生物膜及多种生物活性物质的研究表明,糖类在生物体内具有各种关键的生物学功能,因此糖类的研究成为人们关注的焦点。大量的药理实验表明,多糖类化合物具有免疫增强与调节、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抗放射、抗衰老等作用。日本自20世纪80年代以来,已有数种多糖应用于临床。近年来,日本及欧美学者引进现代分子生物学技术手段,加强对中药多糖活性决定簇等化学结构与功能关系的研究,并在柴胡、当归等中药的研究方面有了一定的突破。国内的研究起步较晚,虽然已在云芝糖肽、银耳多糖等的研究中取得了一定的进展,但对药用多糖的研究仍多偏重于提取、分离、精制、化学组成等方面,大多数品种尚处于实验阶段或仅用于滋补品和饮料,与国外相比仍有一定的差距。2关于多孔分离、纯度和性质的研究2.1原料中多糖提取从不同的材料中提取多糖,一般都先用有机溶剂如丙酮、乙醚、乙醇、甲醇或1∶1的乙醇乙醚混合液脱脂。多糖可用水、0.1~1mol/L氢氧化钠或氢氧化钾碱性水溶液、氯化钠溶液、1%醋酸、1%苯酚等作为提取溶剂,但同一原料用不同试剂提取得到的多糖成分常常是不同的。提取中要防止降解,用稀酸提取时时间宜短,温度最好不高于5℃,用稀碱提取时,为防止降解,常通以氮气或加入硼氢化钠(钾),稀酸稀碱提取后溶液应迅速中和。多糖提取液大多较粘稠,可进行吸滤或用离心法将不溶性杂质除去,提取液经浓缩后,加入2~5倍乙醇或甲醇沉淀多糖,也可加入斐林试剂、硫酸铵或溴化十六烷基三甲胺等使多糖生成沉淀。然后依次用乙醇、丙酮、乙醚洗涤,将吸干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷/氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥。若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时可直接冷冻干燥。干燥后的粉末状粗多糖。除了以上的常规提取方法外,近年来酶法、超声波法在多糖提取中的应用也得到了广泛的关注。2.2糖的分类(1)加标沉淀沉淀根据不同多糖在不同浓度的低级醇、酮中具有不同溶解度的性质,由小到大按比例加入甲醇、乙醇或丙酮等进行分部沉淀。此法适宜于分离各种溶解度相差较大的多糖。(2)盐的分析不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同,常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等,以硫酸铵最佳。此法实际上是分部沉淀的一种。(3)络施工试剂多糖能与铜、钡、钙、铅离子形成络合物沉淀。常用的络合剂有斐林试剂、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。得到的络合物沉淀用5%无机酸乙醇溶液或硫化氢分解。(4)酸的中性化学根据季胺盐能与酸性多糖形成不溶性化合物的特点,以分离酸性多糖。常用的季铵盐有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十六烷基吡啶(CPC)。一般地说,酸性强或分子量大的多糖首先沉淀出来,所以控制季铵盐的浓度,能分离各种不同的酸性多糖。根据形成的沉淀能溶于不同盐、酸溶液和有机溶剂中的性质,将多糖游离出来。(5)中性多糖的纯化常用交换剂为DEAE-纤维素、ECTEOLA-纤维素和羧甲基纤维素。此法适合于分离各种酸性、中性及粘多糖。pH=6时,酸性多糖吸附于交换剂上,中性多糖不吸附,然后用不同离子强度的缓冲液按酸性强弱将各种多糖依次洗脱。洗脱方式可以是阶梯式或梯度式。若pH为碱性,中性多糖也能吸附。中性多糖还能与硼砂形成络合物,若将柱处理成硼砂型后,改变硼砂液浓度也能将不同中性多糖洗脱下来。另外,杂质会吸附于柱上端而达到部分纯化的目的。多糖在柱上的吸附力与其结构有关。吸附力一般随分子中酸性基团的增加而增大。对于线性分子,分子量大的比小的易吸附,直链多糖比分枝多糖易吸附。(6)葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶根据多糖分子大小和形状的不同实现分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex,Sephacryl)及琼脂糖凝胶(Sepherose)。也有人用DEAE-Sephadex分离多糖。(7)电泳是制性区域的特征不同的多糖在电场作用下按其分子大小、形状及所带电荷的不同而达到分离。(8)超滤镜不同的超过滤膜排阻不同分子量和形状的多糖通过,因而达到分离。(9)利用多糖作为聚糖载体分离的活性糖如涂有聚芳香化合物的载体对分离某些多糖很有价值。陈西广等根据多糖与抗血清能产生选择性沉淀的特性,用伴刀豆蛋白(ConA)与Sepharose4B作载体分离纯化了甘露岩藻半乳聚糖。(10)流动相和固定相的分离和迁移HPLC是在经典柱层析原理的基础上,采用分布窄、粒径细的颗粒作载体,将流动相以高压注入柱内,样品组分迅速而不断地在流动相和固定相之间进行反复多次平衡分配,彼此分离,并向下迁移,迁移速率依赖于各组分与固定相之间的相对亲和力。2.3hplc测定多糖纯度不能用通常的标准衡量,因为即使是多糖纯品其微观结构也非均一的。它的纯度只代表某一多糖相似链长的平均分布。通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。纯度鉴定方法有:(1)超离心法。微粒在离心力场中沉降速度与微粒的密度、大小与形状有关。如果某一多糖在离心力场作用下形成单一区带,说明微粒具有相同沉降速度,其分子密度、大小和形状相似。(2)高压电泳法。多糖在电场作用下,按其形状、大小及其所带电荷的不同而移动不同的距离。中性多糖虽然不带电荷,但它的分子中若有顺式的邻二醇,就能与硼砂形成复合物而带电荷,不同多糖的位阻因素决定了多糖与硼砂形成不同的复合物,所以在电场作用下的相对迁移率不同。(3)比旋光度法。不同的多糖具有不同的比旋光度,它们在不同浓度的乙醇中具有不同溶解度,所以,如多糖水溶液经不同浓度的乙醇所得沉淀物具有相同的比旋光度,则证明该多糖为均一成分。(4)凝胶柱层析。多糖经凝胶色谱柱洗脱若只有一个对称的峰,则表明该多糖为均一成分。(5)高效液相色谱。HPLC测定多糖纯度具有速度快、分辨率高和重现性好等优点。目前最常用的商品柱是μ-Bondagel柱系列和TSK柱系列。2.4高效液相色谱的应用常用的多糖分子量测定方法有:渗透法、超离心法、高压电泳法、粘度法、超过滤法、还原末端法、聚合度法、光散射法等。随着耐压合成凝胶的出现,高效液相色谱广泛应用于多糖的纯度和分子量测定上。根据糖的种类可以采用不同的分离方法,如反相色谱、常规氨基烷柱液相色谱、高效离子交换色谱、凝胶渗透色谱、多胺修饰的硅胶色谱、毛细管色谱等。实验室中最常用的是凝胶过滤法,它根据在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积成一定关系的特性,用已知分子量的Dextran系列标准葡聚糖制作标准曲线,由样品的洗脱体积从曲线上求得分子量。3多酚结构分析3.1多酚结构分析的化学方法(1)多糖醛、甲醛反应高碘酸可以选择性地断裂糖分子中连二羟基或连三羟基,生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量进行,每开裂一个C-C键消耗一分子高碘酸。通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量,可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度、支链多糖的分支数目等。(2)采用高碘酸氧化产物是将高碘酸氧化产物还原后进行部分酸水解。由于糖基之间以不同的位置缩合,用高碘酸氧化后则生成不同的产物。将氧化产物用硼氢化合物还原成稳定的多羟基化合物,经酸水解后用纸色谱或气相色谱鉴定水解产物,由降解的产物可以推断糖苷键的位置。(3)糖苷键水解法先将多糖中的各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化,进而将多糖中的糖苷键水解,水解后得到的化合物的羟基所在位置即为原来单糖残基的连接点。同时根据不同甲基化单糖的比例可以推测出这种连接键型在多糖重复结构中的比例。3.2计算多层结构的设备分析(1)多糖衍生化法气相色谱法作为常规的糖类分析方法,可用于糖类的定性分析及定量测定。与质谱联用,分析的灵敏度可进一步提高。多糖可通过酸水解或甲醇解成单糖或单糖甙,然后采用三氟乙酰化、三甲基硅烷化、糖醇乙酰化等方法衍生化,即可进样分析。高效液相色谱近年来也广泛应用于单糖与低聚糖的分析,该方法不需衍生化可直接进样,操作简便,而且有较高分辨率等优点。(2)单糖组分的检测毛细管电泳法与HPLC相比,基柱效更高、速度更快,样品用量仅为HPLC的1%。多糖的酸水解物经衍生化后,以硼砂溶液为缓冲液,各种单糖组分均能被检出,尤其是在HPLC上不易分开的葡萄糖和甘露糖在毛细管电泳中能得到较好的分离。Goubet等还报道了采用荧光基团衍生化糖的还原末端和寡糖,并利用聚丙烯酰胺电泳研究多糖的单糖组成及结构的快速定量方法,检测限可达到500fmol的单糖和100fmol的寡糖。(3)小球糖-和-的端基差向异构体的c-h分析红外光谱图中的每一个吸收峰都相应于分子中原子或官能团振动的情况,利用红外光谱可以鉴定多糖的结构。例如,吡喃糖的α-和β-的端基差向异构体,是由端基的C-H变角振动造成的。α-型的差向异构体的C-H取平伏键,在(844±8)cm-1处有一个吸收峰;β-型的差向异构体的C-H取直立键,在(891±7)cm-1处有一个吸收峰。在多糖分子中若存在甘露糖苷,则一定有810及870cm-1的特征吸收峰。(4)接枝--------------其在13c的nmr上的应用HNMR主要解决多糖结构中糖苷键构型问题;13CNMR的化学位移较1HNMR为广,分辨率高,不但能确定各种碳的位置,而且还能区别分子的构型和构象,特别是带有微型计算机的脉冲傅立叶转换方法在13CNMR上的应用,使得13C天然丰度很低的糖能得到清晰的光谱。(5)不同种类糖链断裂分离的离子检测早期的质谱主要局限于电子解离法(EI-MS),不适用于糖类这种极性强,难挥发高温下易分解的物质。近年发展起来多种不需加热气化的软电离技术,其中应用最广泛的是快原子轰击法(FAB)。FAB法对于热不稳定或难挥发化合物能给出强的准分子离子,便于测定其分子量。同时糖的FAB谱中,强度大的碎片离子往往是糖链断裂后的各残基离子,据此可进行序列分析。由于上述优点,FAB法在糖的研究中得到广泛应用。(6)立体化学的应用绝大多数多糖均不能形成单晶,不适用于常规X-射线单晶衍射。而X-射线衍射的另一方式纤维衍射则在这方面展示了越来越大的应用空间,再加上立体化学方面的信息包括键角、键长、构型角和计算机模拟,就可以准确的确定多糖的构型。尽管研究多糖的立体构型有多种方法如电子衍射、旋光测定、核磁共振等,但X-射线纤维衍射与计算机模拟技术相结合仍不失为当前确定多糖立体构型最为有力的工具。4多酚类4.1多糖化合物对人外周血单核细胞的影响多糖对机体具有双向调节作用,适当浓度的多糖不仅能提高机体的特异性免疫功能,而且能增强机体的非特异性免疫功能。4.1.1多糖对巨噬细胞的激活作用。巨噬细胞是体内非常重要的免疫细胞,在抗感染免疫和抗肿瘤免疫等方面都起重要的作用。但是,未活化的巨噬细胞的吞噬杀伤作用有限,因此活化是巨噬细胞有效地参与免疫监视的先决条件。大量实验表明,海带多糖、玉米花粉多糖、云芝多糖、黄芪多糖、枸杞多糖、牛膝多糖、香菇多糖等可激活巨噬细胞,增强其吞噬作用,能诱导产生IL-1,TNF-d等细胞因子[30,31,32,33,34,35,36]。4.1.2多糖对T、B淋巴细胞的激活作用。多糖化合物特别是从高等植物中提取的多糖,可部分恢复并加强癌症和艾滋病等患者的免疫功能。如白术多糖能明显提高外周血T淋巴细胞ANAE染色率,说明其能促进淋巴细胞向成熟T淋巴细胞转化,提高小鼠细胞免疫功能。当归多糖能直接激活B细胞并对辅助性T细胞的功能具有间接激活作用。香菇多糖是一个典型的T淋巴细胞激活剂。它在体内和体外均能促进特异性细胞毒T淋巴细胞的产生,并提高其杀伤活性。香菇多糖在体内还能提高辅助性T细胞的功能,提高抗体依赖的细胞毒细胞活性。4.1.3多糖对迟发型超敏反应(DTH)的作用。LACA种小鼠连续15d经口给予虫草多糖后在6.85mg/kg剂量下可增强小鼠迟发型变态反应。4.1.5多糖对天然杀伤细胞的影响。人外周血单核细胞在香菇多糖作用下促进NK细胞产生,增强细胞毒作用。4.1.6多糖对LAK细胞活性影响。近年来用LAK/IL-2疗法治疗肿瘤在临床上取得了明显疗效,但该疗法需要大量IL-2和LAK细胞,而IL-2的毒性及价格昂贵限制了它的使用。用增强LAK活性、降低IL-2用量而本身无毒性的生物反应修饰剂是改进该疗法的重要措施。研究表明,猪苓多糖与rIL-2有协同作用,可使内源性LAK活性显著提高。灵芝多糖能明显增强人脐血LAK细胞活性,并能协同rIL-2提高人脐血LAK细胞表面IL-2受体的表达。4.2多酚各种治疗效果4.2.1对免疫调节的作用动物实验及临床观察表明,从细菌、真菌、酵母、地衣和高等植物中提取的多种多糖均具有抗肿瘤活性,表现在抑制肿瘤生长、抑制肿瘤转移、延长生命存活期、提高宿主的免疫系统功能等。其中香菇多糖、裂裥多糖、猪苓多糖和云芝糖肽等已进入临床应用。Geresh等发现硫酸化红藻多糖在200mg/ml浓度下对T细胞淋巴瘤的抑制率可达到80%以上。某些多糖还能对抗化学剂(如三甲基胆蒽)的致癌作用。多糖作为抗癌剂的最大优点是毒副作用少,与化疗联合应用有协同作用,还可以对抗化疗药的骨髓抑制等不良反应。4.2.2香菇多糖对慢性嘴唇炎的预防作用某些多糖通过增强宿主免疫机制可以抵抗细菌、病毒和寄生虫的侵袭。据报道,香菇多糖可用于治疗结核杆菌感染,患病超过十年且产生了耐药性的肺结核病人用香菇多糖治疗一段时间后,病人痰菌转为阴性,嗜中性粒细胞吞噬活性增加。香菇多糖对泡状口角炎病毒感染引起的小鼠脑炎有显著治疗和预防作用,治疗组100%存活,而对照组全部死亡。香菇多糖对阿伯尔氏病毒和十二型腺病毒感染也有效,其抗病毒作用与它诱生IFN和提高NK活性有关。Marina等发现红藻多糖能显著抑制逆转录酶病毒的产生。Lee等报道了从Antrodiacamphorata5种不同菌株的菌丝体中提取的中性多糖均具有抗乙肝病毒作用,其中来自B86菌株的多糖在浓度为50mg/L时抗乙肝病毒能力最强,并高于1000U/ml的μ-IFN,同时所有的多糖均没有细胞毒性作用。4.2.3提取酸性多糖cs-a-3的机制Y.N.Ye等研究表明当归多糖能显著促进正常胃上皮细胞的移动与增殖,具有促进胃粘膜损伤修复与溃疡修复作用。实验表明,从Cuscutachinensis种子中提取酸性多糖CS-A-3β不仅对淋巴细胞增殖与抗体产生具有刺激作用,而且对过氧化氢诱导的细胞损伤具有保护作用。许燕萍等研究了麦冬多糖对脑缺血损伤的抗缺氧作用,结果表明麦冬多糖可使缺血期间脑内乳酸含量下降,从而可逆转缺血后酸中毒造成的各种损害。4.2.4枸杞多糖lbp及其产品口含片的抗氧化活性白花蛇舌草多糖、半枝莲多糖通过提高SOD活力和对负氧自由基的清除作用及抗脂质过氧化作用等起到抗衰老作用。王建华等用衰老模型小鼠和老年小鼠等研究了枸杞多糖(LBP)及其产品口含片的延缓衰老作用,实验表明灌喂LBP能提高D-半乳糖所致衰老小鼠体内GSH-Px和SOD活性,从而可以清除过量的自由基,降低MDA和脂褐素含量,起到延缓衰老的作用。由实验还可知LBP在体外可直接清除羟自由基,并能抑制自发或由羟自由基引发的脂质过氧化反应。4.2.5降血糖活性成分实验证明,桑叶多糖对糖尿病小鼠糖代谢有调整作用,并可