复元胶囊对兔膝骨关节炎软骨中igf-i、igfbp3表达的影响

复元胶囊对兔膝骨关节炎软骨中igf-i、igfbp3表达的影响

骨关节炎（oa）是老年人常见的一种常见的关节疾病，主要是关节软骨的周期性退行性变。软骨合成与降解失衡是其退变的主要病理机制,而细胞生长因子和炎症细胞因子又是介导软骨合成与降解失衡的重要生化因素。IGF-I作为一种具有促生长作用的重要调控因子,能够促进软骨细胞增殖和基质合成,这与中医“主骨生髓”观点类似,因此常用补肾法防治骨关节炎。复元胶囊具有补肾活血作用,可通过降低炎症因子IL-1β、IL-6表达,抑制软骨降解,但该方在促进软骨合成方面还有待于研究。本实验建立兔膝骨关节炎模型,观察软骨IGF-I、IGFBP3表达,探讨复元胶囊防治膝骨关节炎的作用机制。1材料和方法1.1复元胶囊的制备重庆医科大学实验动物中心提供的健康新西兰大白兔44只,雌雄各半,体重(2.5±0.4)kg。合格证:SCXK(渝)20090011。实验药物复元胶囊由鹿茸、淫羊藿、生晒参、黄芪、丹参等组成,重庆希尔安药业有限公司生产,每粒胶囊重0.41g,相当于生药3g,仅供实验使用。对照药物盐酸氨基葡萄糖胶囊(奥泰灵)由香港澳美制药公司生产(国药准字Z20088501),规格为每粒含盐酸氨基葡萄750mg。IGF-I抗兔多克隆抗体、IGFBP3抗兔多克隆抗体、SP免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供。1.2方法1.2.1小组将44只新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、盐酸氨基葡萄糖组、复元胶囊低、中、高剂量组。正常组4只,其余各组8只,每只均单笼饲养。1.2.2现行膝关节培养法所有实验动物同等条件下适应性饲养1w后,除正常组外,其余各组采用右后肢膝关节伸直石膏固定法造模:实验兔放入固定器,先剪去右后肢踝关节以上的兔毛,用医用纱布裹上两层,再用管型石膏将其伸直位固定,石膏外以透明胶纸封好,若石膏松动或脱落者及时重新固定,持续6w,造成膝骨关节炎模型。1.2.3等效剂量及复元胶囊根据Meeh-Rubner公式,按成人(60kg)体表面积与家兔体表面积换算等效剂量,复元胶囊中剂量组给予等效剂量2700mg·kg-1·d-1,复元胶囊低剂量组1350mg·kg-1·d-1,复元胶囊高剂量组5400mg·kg-1·d-1,盐酸氨基葡萄糖组90mg·kg-1·d-1。造模后1w开始给药,除正常组和模型组外,各组药物饮用水溶解后灌胃,1次/d,持续6w。1.2.4骨下骨折组用药6w后,处死实验动物,切取股骨内侧髁完整软骨及软骨下骨组织标本,其中正常组取双后肢软骨做标本,用4%多聚甲醛溶液固定20h,15%EDTA脱钙3～5w,磷酸盐缓冲液充分冲洗,石蜡纵向包埋固定,常规切片。1.2.5不同高倍视野的选取按照免疫组织化学染色法(SP法)操作说明检测IGF-I、IGFBP3表达。每张切片选取6个高倍视野(400倍),其中三个视野包括表中层、三个视野包括中深层,由两个不同观察者完成。细胞染色为黄色或棕色为阳性细胞,参考Pelletier等方法计算每个高倍视野下的阳性细胞计数和细胞总数。IGF-I、IGFBP3阳性软骨细胞用细胞分数表示。1.3统计分析应用SPSS16.0统计软件,数据以x¯±sx¯±s表示,采用单因素方差分析,两组间比较用LSD-t检验。2结果2.1各组小鼠海马绿染色及胞核的染色正常组软骨仅在表层和中上层见到少许阳性细胞;模型组软骨细胞可见不同程度着色,软骨细胞的胞浆及胞核可见黄色及棕色着色,IGF-I以核染色为主,IGFBP3以胞浆染色为主,软骨各层均可见阳性细胞,但以中层更为显著;模型组与盐酸氨基葡萄糖组无明显差异;复元胶囊各剂量组IGF-I表达阳性细胞增多,着色棕黄为主,IGFBP3表达阳性细胞相对减少,着色淡黄为主。见图1。2.2模型各组igf-i、igfbp3表达积分的比较模型组IGF-I、IGFBP3表达积分与正常组比较均升高(P<0.01)。复元胶囊各组与模型组比较,IGF-I表达积分不同程度升高,而IGFBP3表达积分则不同程度降低(P<0.05,P<0.01),高剂量组显著。复元胶囊中高剂量组与盐酸氨基葡萄糖组比较,IGF-I表达积分升高,IGFBP3表达积分降低(P<0.05,P<0.01)。见表1。3复元胶囊治疗骨关节炎的作用机制IGF-I是人体内一种与胰岛素结构相似的重要生长因子,主要由肝脏、骨及软骨组织细胞合成,通过内分泌、旁分泌或自分泌方式作用于靶器官,与组织细胞表面IGF-I受体结合后,激活PI3K和MAPK信号通路发挥多种生物学效应,可以促进细胞增殖、细胞分化、细胞迁移,抑制细胞凋亡,调节生长发育,机体代谢,抗衰老等过程,对机体多个系统的损伤及修复具有十分重要的作用。在软骨中IGF-I通过促进软骨细胞产生基质多糖和胶原蛋白,抑制软骨细胞凋亡,维持软骨合成与降解平衡,但IGF-I这一生理效应受胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)调控,IGFBPs与IGF-I结合可以降低IGF-I与其受体之间的亲和力,从而抑制了IGF-I的生物活性。OA以软骨退行性改变为主要表现,势必存在软骨细胞分泌IGF-I不足,但事实上则相反,国外研究证实在骨关节炎软骨细胞中IGF-ImRNA表达增加,比正常高3.5倍,IGFBP3表达也增加,且比正常高24倍。软骨细胞合成IGF-I增加,理应能够促进软骨合成而发挥自我修复,但是软骨病理形态改变并没有因此减轻,这可能与IGFBP3表达增加更多有关。IGFBP3表达增加,与IGF-I结合增多,抑制IGF-I与其受体结合,从而IGF-I促软骨合成效能降低,导致软骨退变。OA相当于中医“骨痿”“骨痹”范畴。中医认为本病多因年迈肝肾亏虚,气血不足,风寒湿邪侵入骨骼,以致血瘀阻经络所致。肾藏精,主骨生髓;肾精足则骨髓充,骨骼得以滋养,筋骨坚强。本病主要病机特点为本虚标实,本痿标痹,以肾精不足,筋骨失养为本,以痰湿血瘀,痹阻筋络关节为标。复元胶囊从临床上治疗骨关节炎行之有效的复元汤化裁而来,由鹿茸、淫羊藿、丹参、生晒参、黄芪等中药配伍而成,具有补肾活血益气之效。前期研究提示该药可以通过降低骨关节炎软骨中IL-1表达,增强TGF-β2表达,调节MMPs/TIMPs平衡起到防治骨关节炎的作用。现代研究表明鹿茸提取物和淫羊藿提取物能够促进软骨细胞增殖、基