2023学年完整公开课版基因工程

1.1DNA重组技术的基本工具这样的组合，如果用传统的育种方法能否实现？基因工程：突破了生殖隔离，实现不同种生物间的基因重组2．基因工程的原理和理论基础(1)原理：基因重组。(2)理论及技术基础：1、拼接：不同生物DNA的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸；空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。2、表达：生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。3、限制酶和DNA连接酶、质粒等载体和逆转录酶的发现，则直接促使了基因工程的诞生。4、1973年，美国科学家科恩等将两种不同来源的DNA分子进行体外重组，并首次实现了在大肠杆菌中的表达，创立了定向改造生物性状的新技术——基因工程。一、基因工程的概念

基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达理论基础DNA是遗传物质的发现DNA双螺旋结构的确立遗传信息传递方式(中心法则)的认定技术保障基因工程工具的发现和应用

限制性核酸内切酶

DNA连接酶基因载体(如质粒)二、基因工程的诞生提取抗虫基因棉花细胞苏云金芽孢杆菌(有抗虫特征)

普通棉花(无抗虫特征)与运载体DNA拼接，导入(含抗虫基因)

棉花植株(有抗虫特征)基因工程培育抗虫棉的简要过程如何将苏云金芽孢杆菌细胞内的抗虫基因从它的DNA分子中切割下来？如何将切下来的抗虫基因与运载体DNA连接起来？如何将重组的DNA运送到棉花细胞？需要切割DNA的工具（分子手术刀）需要连接DNA片断的工具

（分子缝合针）需要基因转移的工具（分子运输车）

——限制酶——DNA连接酶——基因运载体工具酶思考1、限制性核酸内切酶（简称限制酶）能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。含义：主要从原核生物中分离得到来源：磷酸与脱氧核糖之间的磷酸二酯键

作用部位：有特异性。即一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。作用特点：产生黏性末端或平末端

作用结果：三、基因工程的基本工具EcoRIAAGTTCCTTAAGCTTAAGGAATTC识别GAATTC序列，并在G和A之间切开限制酶在切断DNA时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，他们之间碱基正好互补配对，因此称这些片断为黏性末端。AATTGCCTTAAG3’5’3’3’5’5’5’3’AATTGCCTTAAG要想获得某个特定性状的基因必须用限制性核酸内切酶切几个切口？可产生几个黏性末端？切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端。思考CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATAATATGCTATAEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCTAATCGTTAAAATTGCTATACGGCCGTTAAAATTGCTATA2、DNA连接酶两条链的骨架部分，形成磷酸二酯键

连接部位：具有相同黏性末端的两个DNA片段连接起来，形成重组DNA分子。结果：CGGCCGTTAAAATTGCTATA三、基因工程的基本工具可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶类型：CGGCCGTTAAAATTGCTATACCCGGGGGGCCC

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低。T4DNA连接酶限制酶具有特异性，

DNA连接酶也有特异性吗？

用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要形成几个磷酸二酯键？2个

用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？4个外源基因（如抗虫基因）怎样才能运送到受体细胞（如棉花细胞）？需要“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体思考3、基因载体（运载体）

质粒（最常用）、噬菌体和某些动植物病毒种类：三、基因工程的基本工具化学本质：DNA作用：作为运载工具，将外源基因送入受体细胞。质粒的特点：是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA分子外并能自我复制的小型双链环状DNA分子。能复制并带着插入的目的基因一起复制。有切割位点有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。假如外源基因导入受体细胞后不能复制会怎样？作为载体如果没有限制酶切割位点将怎样？外源基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？会在细胞增殖中丢失

外源的基因不可能插入

如果载体上有遗传标记基因，就可通过标记基因的表达来检测。

将影响受体细胞新陈代谢，进而使转入的外源基因也可能无法表达。思考3、基因载体（运载体）

作为运载工具，将外源基因送入受体细胞。作用：条件：⑴能在宿主细胞内自我复制并稳定地保存⑵有一个或多个限制酶切点，可使外源基因插入其中⑶具有某些遗传标记基因，以便进行筛选⑷对受体细胞无害

质粒（最常用）、噬菌体和某些动植物病毒种类：三、基因工程的基本工具化学本质：DNA小结：“分子缝合针”——DNA连接酶1、作用：把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来。2、作用原理：催化磷酸二酯键形成类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别3、DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶相同点催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键不同点模板不需要模板需要DNA的一条链为模板作用对象游离的DNA片段单个的脱氧核苷酸作用结果形成重组DNA分子形成DNA的一条链用途基因工程DNA复制4、限制酶与DNA解旋酶的比较(1)相同点：都作用于DNA分子中的化学键。(2)不同点①作用部位不同：限制酶作用于磷酸与脱氧核糖之间的磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于两个碱基之间的氢键。②作用结果不同：限制酶在DNA分子特定部位切割DNA；DNA解旋酶是把双链DNA分子间氢键打开使双链DNA成为两个互补的单链DNA分子。5、DNA连接酶与限制酶的比较(1)区别作用应用限制酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键将载体与外源基因组成一个重组DNA分子(2)两者的关系可表示为：【特别提醒】

由于核苷酸分子间的氢键是分子间作用力，其断裂与重新形成均与限制性核酸内切酶、DNA连接酶无关。几种酶的比较：1、科学家们经过多年努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程，实施该工程的最终目的是（）A.定向提取生物体的DNA分子B.定向地对DNA分子进行“剪切”C.在生物体外对DNA分子进行改造D.定向地改造生物的遗传性状D2、以下说法正确的是（）A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B.质粒是基因工程中唯一的运载体C.载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D.基因控制的性状都能在后代表现出来E、DNA连接酶使黏性末端的碱基之间形成氢键C3、人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是（）A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入受体细胞进行检测C.增加质粒分子的分子量D.便于与外源基因连接B4、下列哪项不是基因工程中经常使用的用来运载目的基因的载体（）A.细菌质粒B.噬菌体C.动植物病毒D.细菌核区的DNAD5、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）A.同种限制酶B.两种限制酶C.同种连接酶D.两种连接酶A6、下列有关基因工程和限制性核酸内切酶的描述，错误的是(

)A．一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B．限制性核酸内切酶的活性受温度的影响C．限制性核酸内切酶能识别和切割RNAD．限制性核酸内切酶可从原核生物中提取C1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、获取方法：（1）自然界直接分离获取（2）人工方法（1）从基因文库中获取目的基因（2）利用PCR技术扩增目的基因（3）通过DNA合成仪用人工化学方法直接合成一、目的基因的获取（1）从基因文库中获取目的基因：（2）利用PCR技术扩增目的基因（3）人工合成法基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含一种生物的部分基因，如：cDNA文库1、基因文库

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。（2）部分基因文库（cDNA文库）（1）基因组文库（1）构建基因组文库直接分离法--鸟枪法

用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生多种互补DNA（也叫做cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就是这种生物的cDNA文库（一种部分基因文库）。基因组文库与cDNA文库有什么区别呢？（2）部分基因文库（cDNA文库）P10基因的结构原核真核1.原核基因编码区(连续)非编码区2.真核基因编码区外显子内含子间隔，不连续非编码区非编码序列原核真核1.原核基因编码区(连续)非编码区2.真核基因编码区外显子内含子间隔，不连续非编码区非编码序列启动子课本P11外显子内含子内含子结构基因转录前体mRNA加工修饰成熟mRNAcDNA反转录a、高温变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，

断裂，形成

。b、低温复性25℃-65℃：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部______。c、中温延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的

。氢键单链DNA双链DNA链2、利用PCR技术扩增目的基因DNA双链复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸（原料）、DNA的两条链为模板热稳定DNA聚合酶(Taq酶）、一对引物、温度控制等原理：前提：条件：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。2、利用PCR技术扩增目的基因扩增方式：以指数方式（2n）扩增目的基因的mRNA逆转录单链DNA合成双链DNA（目的基因）蛋白质氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列推测结构基因的核苷酸序列化学合成目的基因3、人工合成法（针对较小、已知核苷酸序列较小的基因）：（1）逆转录法（2）根据已知氨基酸序列直接合成DNA一、目的基因的获取1、自然界直接分离获取2、人工方法（1）从基因文库中获取目的基因（2）利用PCR技术扩增目的基因（3）通过DNA合成仪用人工化学方法直接合成基因工程的基本操作步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建（基因工程的核心）1、运载体的条件是什么？

⑴复制原点⑵限制酶切点

⑶标记基因⑷无害

复制原点

+

启动子

+

目的基因

+

终止子

+

标记基因2、表达载体（重组DNA）的组成是什么？

它们各自的作用是什么?2、操作表达载体（重组DNA）的构建过程：

运载体

+目的基因✔️目的基因自身的环化❌运载体自身的环化❌CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATAATATGCTATAEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCTAATCGTTAAAATTGCTATACGGCCGTTAAAATTGCTATAGAATTC······GACGTCTGCTTAAG······CTGCAGACG···CTGCAAATTC···G酶I酶Ⅱ用不同的限制酶切割目的基因目的基因CTTAAGACGTGCGAACTTGAACTT······GACGTCCTGCAG酶Ⅰ酶Ⅱ载体用不同的限制酶切割G···CTGCAAATTC···GCTTAAGACGTGC①②③④目的基因载体

①和③、②和④应该符合什么条件？目的基因基因工程的基本操作步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法1、下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是A.②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异思考：利用基因工程合成具有生物活性的基因产物（如：胰岛素等），则应选择下列哪个作为受体细胞(

)A、病毒B、哺乳动物成熟红细胞C、大肠杆菌D、酵母菌

受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物细胞等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物,如利用酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌);一般不用支原体,原因是它营寄生生活;一定不能用哺乳动物成熟的红细胞,原因是它无细胞核,不能合成蛋白质。基因工程的基本操作步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定4、目的基因的检测与鉴定目的基因检测：DNA分子杂交技术转录检测：DNA—RNA分子杂交技术翻译检测：抗原—抗体杂交技术个体性状水平检测：个体抗性接种实验分子杂交技术：

1、DNA探针:

含目的基因的DNA片段

2、同位素标记法：（1）光合作用中氧气的来源，碳元素的循环（2）用H标记氨基酸，探究分泌蛋白的合成和运输及生物膜的转换（3）用P和S分别标记噬菌体的DNA和蛋白质，探究DNA是遗传物质（4）用N标记DNA分子，