力竭运动过程中大鼠纹状体内神经递质的动态变化

力竭运动过程中大鼠纹状体内神经递质的动态变化

根据初步研究，运动疲劳后，大鼠图像高信号放电源的比例显著增加，金元爆发放电活动增多，金元兴奋增强。初步证实，条纹体参与了运动的调节，也是导致运动疲劳的重要中风因素之一。神经元间的信息传递主要通过神经递质实现,故推测电变化与脑内神经递质变化有关。因此,围绕运动疲劳与神经递质之间的关系展开研究成为新近关注的热点。然而,由于受到研究技术的限制,目前的研究结果多以断头取脑的方法获得,只能通过运动结束后脑神经递质的变化特征间接反映运动中的状况,有一定的时间滞后性。为此,本研究采用微透析和高效液相色谱(highpressureliquidchromatographytechniques,HPLC)联用技术,对一次性力竭运动过程中大鼠纹状体细胞外液神经递质谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)变化规律进行活体动态观察,探讨纹状体内神经递质在运动疲劳产生、发展和恢复过程中的变化规律,并进一步解释运动疲劳过程中纹状体神经元电活动改变的可能机制。1材料和方法1.1实验动物及原料选用清洁级健康雄性wistar大鼠8只,8周龄,体重250g±10g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2002-2003,京ICP备05076685号。常规分笼饲养,自由饮水进食,自然光照,动物房内温度20℃±3℃,相对湿度为40%~60%。1.2试剂与标准液主要仪器:微量注射泵(BAS,MD-0250),微透析探针(BAS,MD-2204),微透析探针套管(BAS,MD-2251),三维立体定位仪(日本成茂,SN-3N),高效液相色谱仪(日本岛津LC-20A),荧光检测器(日本岛津,RF-10AXL),色谱工作站(日本岛津),色谱分析柱(日本岛津,BDSC18柱,4-6mm×250.0mm,5μm),颅骨钻(MF-5362,SiliteCorporation)。主要试剂:邻苯二甲醛(OPA,Sigma),β-巯基乙醇(β-MCE,Sigma),Glu和GABA标准品(Sigma),甲醇色谱醇(MeOH,Baker),磷酸二氢钾,四硼酸钠,无水碳酸钠等,高效液相所用试剂均为国产分析纯。所有溶液均用超纯水(Millipore)配制,并以0.2μM无菌过滤器过滤,冷藏备用。VVGlu和GABA标准溶液:精密称取Glu和GABA标准品,分别配置成0.4mmol/L的Glu和0.2mmol/L的GABA标准溶液;衍生试剂:精密称取OPA125mg,用2.5ml甲醇溶解后,加入25ml浓度为0.4mol/L的硼酸缓冲液(pH9.5),涡旋混匀,再加入100μlβ-巯基乙醇;人工脑脊液(aCSF):NaCl(126mM),KCl(2.4mM),KH2PO4(0.5mM),MgCl2(0.85mM),NaHCO3(27.5mM),Na2SO4(0.5mM),CaCl2(1.1mM)。1.3骨性标志的设置大鼠以戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉,俯卧固定于脑立体定位仪上,沿大鼠头顶正中线做矢状切口,暴露前、后囟及冠、矢状缝等骨性标志。调整门齿高度,使前囟和后囟处在同一水平面上。依照大鼠脑立体定位图谱,在纹状体对应的颅骨部位钻孔,掀去硬脑膜。将透析套管定植入左侧纹状体(P:0.2,L:3,H:3.2),并用小螺钉和牙科水泥固定,保证导轨不随动物的正常活动而移动或松动。术后4~5d,手术引起的不良反应即可消失,大鼠饮食和行为恢复正常,开始进行恢复性的递增负荷运动训练。1.4增加负荷跑台运动方案待大鼠能够以20m/min的速度跑30min,并未见不良反应,即可进行正式实验。一次性力竭运动采用本实验室建立的递增负荷跑台运动方案,跑台坡度为0°,负荷分为3级:I级,8.2m/min,15min;II级,15m/min,15min;III级,20m/min,运动至力竭。力竭判定标准为:动物不能维持预定跑速,滞留于跑道后挡板不动,使用光、电、声刺激驱赶仍无效,并伴有呼吸急促、俯卧跑台、垂头不起等行为表现。1.5glu和gaba的测定开启透析灌流系统,调节恒流泵控制液体流速为2μl/min,将透析探针插入预先植入脑内的探针导轨,并与人工脑脊液灌流系统直接相连(图1)。灌流平衡60min后开始运动,在运动过程中和恢复期90min内收集透析液,采样频率为1次/30min,每次采集样品量为60μl,并及时放入-20℃冰箱中保存待测。OPA柱前衍生:准确提取30μlGlu、GABA标准溶液或微透析样品液,再加入0.05mol/L的碳酸钠溶液15μl和15μl衍生试剂,混匀45s后静置反应30s进样,进样量为25μl。Glu和GABA测定:采用高效液相色谱(荧光检测)法(日本岛津公司液相色谱仪)。色谱条件:激发波长(Ex)=357nm、发射波长(Em)=455nm,柱温箱25℃,色谱柱为日本岛津公司C18柱(5μm,250.0mm×4.6mm)。采用梯度洗脱,流动相为A相甲醇:B相磷酸二氢钾缓冲液(pH6.6)=40:60;将30μl透析液样品加入Na2CO3和衍生剂各15μl,混匀45s后静置30s进样,进样量为20μl。标准曲线的测定:精密量取Glu和GABA标准品,分别配成10、1、0.1、0.01和0.001μmol/L的混合溶液,测定各浓度峰面积。以浓度为横坐标、以峰面积为纵坐标,计算出样品Glu的标准曲线为:Y=2681511.8302X+38573.3392(r=0.9994)(图2A),样品GABA的标准曲线为:Y=3170360.4892X+194408.5210(r=0.9999)(图2B)。应用标准曲线计算微透析液中各物质的含量。采用高效液相色谱分析的方法检测Glu和GABA标准样品,确定待测物质的保留时间(如图3A)。然后检测大鼠纹状体的透析液样品,将Glu和GABA两种神经递质进行有效分离(如图3B)。1.6大鼠造林大鼠微透析实验结束后,用10%水合氯醛按0.35ml/kg剂量腹腔麻醉大鼠,仰卧位固定四肢。打开胸腔,用4%福尔马林溶液经心脏常规灌流固定,取出脑组织,冠状面做切片,对照大鼠脑立体定位图谱鉴定探针尖端所在位置(图4),探针未准确插入纹状体的数据将被删除。1.7实验结果的描述实验过程中,采样是连续进行的,采样速度是2μl/min,由于分析方法要求的最少进样量为30μl,因此采样时间至少需15min以上。本实验选取30min为一个点,以在某一30min时间内收集到的60μl样品中的神经递质含量反映此时间段内递质的水平。实验过程中,大鼠不能都正好在整点或半点力竭。为此,将大鼠力竭点所属的那个30min时间段命名为力竭期。大鼠运动至力竭的时间个体差异较大(163.00min±30.12min),但一般都在2h以上,故在力竭期前均至少可收集到2个或2个以上的30min样品,这两个点分别定义为力竭期前60min和力竭期前30min;力竭期后的时间点分别定义为力竭期后30min、力竭期后60min和力竭期后90min。即以力竭期所属的时间段为参考,往前取2个点的样、往后取3个点的样进行统计。为便于区分大鼠在力竭运动过程中不同阶段纹状体胞外Glu和GABA水平的动态变化特征,将整个实验过程划分为4个阶段:安静状态(0);运动状态Ⅰ(30~60min);运动状态Ⅱ(力竭期前60min~力竭)和恢复状态(力竭~恢复90min),运动状态Ⅰ与运动状态Ⅱ之间的时间点忽略,以保证检测样本统计处理的一致性。以每只大鼠安静时透析液物质的平均浓度为基础值,以不同时间段样品透析液物质浓度占基础值浓度的百分比反映其变化规律。所有数据均用平均数±标准差(ue0af±s)表示,应用SPSS11.0统计软件进行RepeatedmeasuresANOVA分析,P<0.05表示差异显著性。2结果2.1glu对gaba和glu的影响图5显示,Glu从运动开始出现上升,力竭期前60min达到峰值,之后开始下降,在恢复期30min降到最低点,之后又回升。与安静状态相比,Glu水平在运动60min、力竭期前60min、力竭期前30min、力竭期及其后90min恢复期内均显著升高(P<0.05,P<0.01)。图6显示,GABA水平变化趋势与Glu相反,从运动开始即缓慢下降,从运动状态Ⅱ开始急剧下降,力竭期前30min下降至最低点,之后上升,并在力竭期几乎达静息水平。GABA水平在力竭期前60min、力竭期前30min及力竭期后60min的恢复期均显著低于安静状态(P<0.05,P<0.01)。2.2东北部下降、下降、下降、下降由图7可见,Glu/GABA比值从运动开始上升,力竭期前60min达到最高,之后下降,在恢复期30min降到最低,之后缓慢上升。与安静状态相比,Glu/GABA比值在力竭期前60min、力竭期前30min、力竭期及其后恢复60min和90min时均显著升高(P<0.05,P<0.01)。3glu神经元自由基因子检测纹状体是基底神经节中接收皮层传入信息的主要核团,皮层发出的Glu能神经纤维按一定的定位排列投射到纹状体,再由纹状体发出GABA能神经纤维,经直接或间接通路到达苍白球内侧部(GPi)/黑质网状部(SNr),经丘脑返回皮层。其功能不仅与随意运动的执行和调节有关,而且在运动可塑性方面也起着关键作用。Glu是脑内含量较高的氨基酸,对神经元有兴奋调控作用,属兴奋性神经递质;GABA在脑组织中有抑制突触传导的作用,属抑制性神经递质。因此,脑组织Glu、GABA含量及其比值常被作为评定神经元兴奋性的重要指标之一。本研究中,在运动状态Ⅰ,大鼠纹状体Glu水平及Glu/GABA比值上升,GABA水平下降;而在运动状态Ⅱ至力竭后30min的恢复期内,大鼠纹状体Glu水平及Glu/GABA比值均下降,GABA水平总体上升。我们发现,神经递质水平的动态变化与大鼠行为学表现基本一致。运动开始时大鼠体力充沛、精神饱满;但运动约30min(运动状态Ⅰ末)左右出现疲劳症状,不能按预定强度继续运动;此时给予驱赶、声、光、电等刺激,大鼠可继续维持原有强度运动很长时间(运动状态Ⅱ),直到力竭。Potts等研究发现,长时间运动引起脑Glu含量增加和Glu/GABA比值下降;而Ishide等的研究发现,短时间大强度剧烈运动引起脑Glu升高而GABA降低。这些结果与本研究结果基本一致。神经递质Glu含量增加,一方面可能是神经系统对运动的一种代偿性反应,增加运动神经元的兴奋性,维持运动神经元的节律性活动,促进运动神经元突触信号的传递及整合作用,满足运动需要。另一方面,关于中枢神经系统缺血缺氧的相关研究证实,Glu具有兴奋性毒性作用,即当细胞外液Glu持续增加到一定浓度时,神经系统会因过度兴奋而损伤。本实验发现,大鼠运动疲劳后纹状体内Glu含量明显升高,说明Glu能神经元兴奋性增强;而Glu能神经元与纹状体神经元之间存在广泛的突触联系,疲劳后Glu含量上升可能是导致纹状体神经元高频放电比例增加、神经元兴奋性增强等电活动改变的原因之一。GABA则是纹状体内抑制性递质,主要通过影响Cl-通道、增加Cl-内流而降低运动神经元的兴奋性。GABA从运动状态Ⅱ开始急剧下降,力竭期前30min下降至最低,之后开始上升并在力竭时达到静息水平。这表明大鼠力竭时纹状体内兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸的代谢失衡,抑制性神经递质GABA活动起了主导作用。由此推论,神经递质Glu和GABA在运动疲劳不